Изучение влияния температуры на нефтеокисляющую активность микроорганизмов-кандидатов в ассоциацию-деструктор

/

Министерство образования и науки Республики Казахстан

Казахский национальный университет им. аль-Фараби

ДИПЛОМНАЯ РАБОТА

специальность 5В070100 - «Биотехнология»

Т?легенова Д.А.

Алматы 2014

Министерство образования и науки Республики Казахстан

Казахский национальный университет им. аль-Фараби

Кафедра биотехнологии

«Допущен к защите»

___________ Заведующим кафедрой биотехнологии Заядан Б.К.

ДИПЛОМНАЯ РАБОТА

На тему: «ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ТЕМПЕРАТУРЫ НА НЕФТЕОКИСЛЯЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ-КАНДИДАТОВ В АССОЦИАЦИЮ-ДЕСТРУКТОР»

по специальности 5В070100 - «Биотехнология»

Выполнила Т?легенова Д. А..

Научные руководители

к. б. н., доцент

Кайырманова Г. К.

Нормоконтролер

Бектилеуова Н.К.

Алматы, 2014

РЕФЕРАТ

Дипломная работа состоит из 50 страниц, 8 рисунков, 10 таблиц, 44 источников литературы.

Ключевые слова: нефтешлам, углеводородокисляющие микроорганизмы, влияние температуры.

Цель работы: изучение влияния температурных условий на нефтеокисляющую способность аборигенных углеводородородокисляющих микроорганизмов.

Задачи: выделить культуры нефтеокисляющих микроорганизмов из жидких и твердый проб нефтешлама, а также выявить влияние температур +5° С, +20° С, +60° С на нефтеокисляющую активность.

Методы: метод выделения накопительных культур нефтеокисляющих микроорганизмов, метод выделения чистых культур, метод идентификации микроорганизмов, методы изучения роста микроорганизмов при температуре -5° С, +20° С, +60° С, метод количественного определения микроорганизмов.

Результаты: выявлено, что выделены культур нефтеокисляющих микроорганизмов оказались не способны к утилизации нефти при +5° С, +60° С, а при при +20°С - обильный рост наблюдался у культур Рs. ssр. ЗГ-2, Рs. ssр. БШС-1 и Рs. аеruginоsа Н14

Практическое использование: Изучению влияния температурных условий на их нефтеокисляющую активность могут быть использованы в создании биопрепарата на основе ассоциации музейных культур микроорганизмов с аборигенными культурами для биоремедиации земель с высокой степенью нефтезагрязнения.

РЕФЕРАТ

Диплом ж?мысы 50 беттен, 8 суреттен, 10 кестеден ж?не 44 ?дебиет к?здерінен т?рады.

Т?йін с?здер: м?най ?алды?ы, к?мірсутек тоты?тырушы микроорганизмдер, температура ?сері, полигон-жина?таушы, 'Жанажол' кен орны.

Зерттеу ж?мысыны? ма?саты: жергілікті к?мірсутек тоты?тырушы микроорганизмдерді? м?найды тоты?тыру ?абілетіне температура ?серін зерттеу.

Ж?мысты? міндеттері: с?йы? ж?не ?атты к?йдегі м?най ?алды?ы сынамаларынан м?най тоты?тырушы микроорганизмдер да?ылдарын б?ліп алу, ж?не оларды? м?най тоты?тырушы белсенділігіне +5°С, +20°С, +60°С температураларды? ?серін ай?ындау.

Зерттеу ?дістері: м?най тоты?тырушы бактерияларды? жина?ты? да?ылын б?ліп алу, микроорганизмдерді? таза да?ылын алу ?дісі, микроорганизмдерді идентификациялау, микроорганизмдерді? -5°С, +20°С ж?не +60°С температураларда ?суін ба?ылау, Кох ?дісі бойынша микроорганизмдерді? санын аны?тау.

Алын?ан н?тижелер:

1) М?най ?алды?ыны? 6 т?рлі сынамасынан, м?най тоты?тырушы микроорганизмдерді? 10 т?рлі да?ылдары б?лініп алынды;

2) Б?лініп алын?ан да?ылдар +5° С, +60° С температура кезінде, м?найды? утилизациясына ?абілетсіз болып шы?ты, +20°С жо?ары м?най тоты?тыру белсенділігін к?рсеткен Рs. ssр. ЗГ-2, Рs. ssр. БШС-1 и Рs. аеruginоsа Н14да?ылдар болды.

Практикалы? ?олдануы: М?найды тоты?тыру белсенділіктеріне температураны? ?серін зерттеу ж?ргізу ар?ылы, микроорганизмдерді? м?най тоты?тырушы ?абілеттіліктерін, жо?ары д?режеде м?наймен ластан?ан жерді? биоремедиациясы ?шін, м?най тоты?тырушы микроорганизмдерді? м?ражайлы да?ылдары мен жергілікті микроорганизм да?ылдарыны? ассоциациясы негізінде биопрепараттар алу ?шін ?олдану?а болады.

АBSTRАСT

Diрlоmа wоrk inсludеs 50 раgеs, 8 figurеs, 10 tаblеs, 44 litеrаturе sоurсе.

Kеywоrds: оil-slimе, hydrосаrbоn оxidizing miсrооrgаnisms, influеnсе оf tеmреrаturе, роlygоn- rеsеrvоir, оilfiеld “Zhаnаzhоl”.

Gоаl оf rеsеаrсh: rеsеаrсh thе influеnсе оf tеmреrаturе оn thе оil-оxidizing асtivity оf thе аbоriginаl hydrосаrbоn оxidizing miсrооrgаnisms.

Оbjесtivеs: thе аllосаtiоn thе сulturе оf оil-оxidizing miсrооrgаnisms оf liquid аnd sоlid sаmрlеs frоm оil-slimе аnd rеvеаl thе influеnсе оf tеmреrаturе +5 ° С, +20 ° С, +60 ° С tо thе оxidizing асtivity оf isоlаtеd сulturеs.

Mеthоds: thе аllосаtiоn сumulаtivе сulturеs оil-оxidizing miсrооrgаnisms, thе аllосаtiоn bасtеriоlоgiсаlly рurе сulturеs оf miсrооrgаnisms, thе mеthоd оf idеntifiсаtiоn оf miсrооrgаnisms, mеthоds оf rеsеаrсhing thе grоwth оf miсrооrgаnisms аt thе tеmреrаturе -5 С, +20 С аnd +60 С, quаntifying miсrооrgаnisms by Kосh mеthоds.

Mаin rеsults:

1) frоm 6 sаmрlеs оf оil-slimе аllосаtеd 10 сulturеs оf оil-оxidizing miсrооrgаnisms,

2) сulturеs wеrе nоt сараblе оf utilizing оil аt +5 С аnd +60 С, аnd аt +20 С thе Рs. ssр. ЗГ-2, Рs. ssр. БШС-1 и Рs. аеruginоsа Н14 wеrе сараblе оf utilizing оil.

Аррliсаtiоns: Thе rеsеаrсh influеnсе оf tеmреrаturе соnditiоns оf оil-оxidizing асtivity саn bе usеd in thе сrеаtiоn оf а biоlоgiсаl рrоduсt оn thе bаsis оf аssосiаtiоn оf аbоriginаl сulturеs оf miсrооrgаnisms with thе musеum сulturеs оf оil-оxidizing miсrооrgаnisms fоr biоrеmеdiаtiоn оf sоils with high оil роllutiоns.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. Обзор литературы

1.1 Влияние нефтезагрязнений на окружающую среду

1.2 Биотехнологические методы очистки нефтезагрязненных экосистем

1.3 Влияние температуры окружающей среды на микробную деградацию углеводородов в почве

2. Материалы и методы исследования

2.1 Материалы исследования

2.2 Методы исследования

2.2.1 Получение накопительных культур нефтеокисляющих микроорганизмов

2.2.2 Методы выделения бактериологически чистых культур УОМ и изучения их морфо-культуральных свойств

2.2.3 Определение роста микроорганизмов при различных температурах

2.2.4 Определение количества микробных клеток высевом на плотные питательные среды (Метод Коха)

3. Результаты исследования и их обсуждение

3.1 Выделение и изучение аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов

3.2 Изучение нефтеокисляющей активности микроорганизмов при различных температурных режимах

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

УОМ Углеводородокисляющие микроорганизмы

ОМЧ Общее микробное число

КОЕ Колониеобразующа единица

Рs. Рsеudоmоnаs

Bас. Bасillus

ssр. от лат. «subsресiаlеs» - подвиды

нефтезагрязнитель углеводородокисляющий микроорганизм углеводород

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. Казахстан - одна из ведущих стран мира по запасам нефти и газа и их добыче. На долю нефтедобывающей промышленности уже сейчас приходится более 40% объемов промышленного производства и экспорта [1]. На сегодняшний день только в Актюбинской области имеются 12 полигонов-накопителей отходов нефтепромышленности, занимающих значительные территории, тем самым снижая площадь хозяйственно-значимых пахотных и пастбищных земель, и являясь вторичным источником загрязнения окружающей среды [2].

Существует большое количество биопрепаратов для биоремедиации нефтезагрязненных почв. Наиболее эффективно выявление активных деструкторов компонентов нефти среди аборигенных микроорганизмов для создания биопрепаратов для нивелирования влияния отходов нефтедобычи полигонов-накопителей. Климатические условия Актюбинской области характеризуются холодной зимой и жарким летом. Температура может колебать от -42° С зимой до +65° С летом. В связи с этим применение биопрепартов с микроорганизмами, не приспособленными к таким климатическим условиям не эффективны в процессе биоремедиации нефтезагрязненных почв.

Цель исследований: изучить влияние различных температур на нефтеокисляющую способность микроорганизмов.

Задачи:

- выделить культуры нефтеокисляющих микроорганизмов из жидких и твердых отходов полигона-накопителя нефтешлама,

- выявить влияние температур +5° С, +20° С, +60° С на нефтеокисляющую активность выделенных культур.

Объекты исследования: коллекционная культура Рsеudоmоnаs аеruginоsа Н14 кафедры биотехнологии Казахского национального университета им. аль-Фараби, аборигенные углеводородокисляющие культуры микроорганизмов, выделенные из нефтешлама полигона- накопителя месторождения «Жанажол».

Работа выполнена в лаборатории прикладной микробиологии кафедры биотехнологии КазНУ им. аль-Фараби и ДГП на ПХВ «НИИ Проблем Биологии и Биотехнологии» РГП «КазНУ имени аль-Фараби» в рамках научно-исследовательского проекта: «Создание новых биопрепаратов для нивелирования действия нефтедобычи на окружающую среду (на примере полигона-накопителя месторождения «Жанажол» Актюбинской области)», 2012-2014 гг. - научн.рук. проф. А.А.Жубанова. В работе использовались традиционные микробиологические методы исследования.

1. Обзор литературы

1.1 Влияние загрязнения нефти на окружающую среду

Нефть, продукты ее переработки оказывают отрицательное воздействие на воздух, воду и почву.

Экологические проблемы начинаются уже на стадии добычи нефтяного сырья и его поставки на предприятия. Наиболее характерными загрязнителями окружающей среды являются углеводороды (44,9% от суммарного выброса), оксид углерода (47,4%) и различные твердые вещества (4,3%). Не менее острые проблемы возникают при транспортировке нефти на нефтеперерабатывающие предприятия. Нефть транспортируется по трубопроводам, подверженным коррозии, отложениям смол и парафинов внутри труб. В среднем в год происходит более 60 крупных аварий и около 20 тыс. случаев разливов нефти на суше и в водоемах, сопровождающихся гибелью людей и большими материальными потерями [3].

В нефтедобывающие предприятия Казахстана решали проблемы, создаваемые накопленными отходами, строительством шламонакопителей. Однако на сегодняшний день только в Актюбинской области имеются 12 полигонов по размещению отходов производства углеводородного сырья, занимающих значительные территории, и потому не только заметно снижающие площади хозяйственно-значимых пахотных и пастбищных земель, но и являющиеся вторичным источником загрязнения окружающей среды [1].

Нефтешламы (нефтяные шламы) -- это сложные физико-химические смеси, которые состоят из нефтепродуктов, механических примесей (глины, окислов металлов, песка) и воды. Соотношение составляющих нефтешлам элементов может быть самым различным.

Нефтяные шламы образуются при проведении таких производственных процессов, как переработка, добыча и транспортировка нефти. Данный тип отходов представляет большую опасность для окружающей среды и подлежит захоронению или переработке [4].

Образовываться нефтешламы могут как в результате естественных контролируемых процессов, так и от всевозможных аварий. В последнем случае при позднем обнаружении или масштабной аварии природе может быть нанесён огромный ущерб.

В зависимости от способа образования и, соответственно, физико-химического состава нефтяные шламы подразделяются на несколько групп или видов:

- Придонные, образующиеся на дне различных водоёмов после произошедшего разлива нефти.

- Образующиеся при бурении скважин буровыми растворами на углеводородной основе.

- Образующиеся в процессе добычи нефти, а, точнее, в процессе её очищения. Дело в том, что добытая из скважины нефть содержит многочисленные соли, выпавшие твёрдые углеводороды, механические примеси (в том числе и частицы горных пород).

- Резервуарные нефтешламы -- отходы, которые образуются при хранении и транспортировке нефти в самых разнообразных резервуарах.

Грунтовые, являющиеся продуктом соединения почвы и пролившейся на неё нефти (причиной этого может быть, как технологический процесс, так и авария). Этот вид нефтешламов (загрязненных почв) относится к отходам только после размещения в накопителях отходов или на полигонах для переработки отходов.

Углеводородный (нефтяной) компонент нефтешламов может быть представлен различными соединениями, которые в результате длительного хранения, под действием природных сил, могут преобразовываться в другие соединения за счет процессов конденсации, полимеризации, изомеризации.

Переработка и утилизация нефтешламов -- это важная экологическая и экономическая задача.

Разливы нефти на суше вызывают значительные, порой необратимые изменения ее свойств, такие как образование битуминозных солончаков, гудронизацию, цементацию и т. д. Эти изменения влекут за собой ухудшение состояния биоразнообразия растительного и животного мира. В результате нарушения почвенного покрова и растительности усиливаются такие процессы как эрозия почв, деградация, криогенез.

Основные загрязнители почв в нефтяной и газовой отраслях можно разделить на три типа: жидкости (нефтяные углеводороды, буровые растворы); газы (попутный и природный газ и продукты его сгорания); твердые вещества (шламы, серная пыль в районах предприятия переработки сернистого углеводородного сырья).

При химическом загрязнении почвы изменяются ее физические, химические, ионообменные свойства и биологическую активность. В случае изменения показателей этих свойств почвы целесообразно использовать в качестве признаков ее деградации. Это актуально для объектов нефтегазового комплекса, так как в данном случае задача определения ПДК усложняется многокомпонентностью большинства загрязнителей почвы [5].

Нефть обладает ярко выраженными и гидрофобными свойствами и, которые передаются почвенным частицам. О резком увеличении гидрофобности в нефтезагрязненной почве можно судить по изменению некоторых показателей водно-физических свойств.

С ростом нефтяного загрязнения влажность почвы возрастает с увеличением нефтепродукта в 2 раза в среднем на 1%. Причиной этого является снижение скорости транспирации влаги через лежащий слой, загрязненный нефтью. Мульчирование слоя почвы толщиной в 1 см с различной степенью загрязнения приводит к 3-хкратному снижению скорости транспирации в зависимости от дозы нефти. При использовании незагрязненной почвы скорость транспирации на 4-е сутки составляла. 82+2 мм/см2 в сутки, при дозе нефти 8 л/кв.м. - 37+3, при 16,24 л/м2- 25+6, это свидетельствует о значительных нарушениях водного и воздушного режимов нефтезагрязненных почв, приводящих к развитию анаэробных процессов в почве.

Воды, сопутствующие нефти, часто содержат высокие концентрации солей натрия, что, в свою очередь, оказывает в значительной мере влияние на такое свойство почвы, как липкость, которая по мер насыщения в составе поглощенных оснований натрия резко увеличивается. В результате увеличивается тяговое сопротивление и ухудшается качество обработки почвы.

От наличия натрия в почвенном поглощающем комплексе зависит и пластичность почвы - это способность почвы изменять свою форму под влиянием какой-либо внешней силы без нарушения целостности и сохранить приданную форму после устранения этой силы. Наибольшей пластичностью отличаются почвы, содержащие более 25% обменного натрия от емкости поглощения.

С липкостью почвы в свою очередь тесно связано такое важное агрономическое свойство почвы как физическая спелость - это когда у почвы при обработке исчезает свойство прилипать к сельскохозяйственным орудиям и появляется способность крошиться на комки.

С увеличением в составе обменов катионов натрия возрастает способность почвы к набуханию - увеличению объема почвы при увлажнении. При насыщении почвы натрием набухание достигает 120-150%.

Набухание почвы вызывает неблагоприятные в органическом отношении изменения в поверхностном слое почвы, приводящие к разрушению структуры почвы и ее агрегатов.

Усадка - сокращение объема почвы при высыхании. Величина усадки обусловлена теми же факторами, что и набухание. Чем больше набухание, тем сильнее усадка почвы. При сильной усадке в почве образуется многочисленные трещины, происходит разрыв корневой системы растений.

Такое важное свойство почвы как твердость также непосредственно связано с составом поглощенных оснований, при насыщении натрием твердость увеличивается в 10-15 раз, отсюда резко возрастает технологическая характеристика почвы - сопротивление обработке.

При загрязнении почвы нефтью и нефтепродуктами резко ухудшается водно-воздушные свойства почвы, такие как влагопроницаемость, влагоемкость, воздухопроницаемость и воздухоемкость.

Существенное влияние оказывает на тепловые свойства почвы загрязнение ее поверхностного слоя нефтепродуктами. Теплопоглотительная способность почвы характеризуется величиной альбедо (А), которая показывает, какую часть поступающей лучистой энергией отражает почва. Для черного тела, целиком поглощающего поступающую лучистую энергию Солнца, альбедо будет стремиться к 0, таким образом, у загрязненных почв резко изменяется тепловой режим.

Кроме изменения физических свойств загрязнения почв нефтью сопровождается значительными изменениями химических свойств: как уже говорилось выше, высокие концентрации солей натрия в сопутствующих водах попадая в почву и почвенно-поглощающий комплекс (ППК) кроме прямого токсичного действия вытесняет кальций, что вызывает заметное изменение почвенной кислотности в сторону подщелачивания. Так рН водной суспензии верхних горизонтов почв может подниматься до 8.

В почвах, загрязненных нефтью, изменяются окислительно-восстановительные процессы, которые оказывают большее влияние на почвообразовательный процесс и плодородие почв. С этими процессами тесно связаны превращение растительных остатков, темпы накопления и состав образующих органических веществ, превращение соединений азота, серы, фосфора, железа, марганца в почвах. При падении окислительно-восстановительного потенциала развивается денитрификация.

В результате загрязнения почвы нефтью происходят изменения агрохимических свойств. В изменении окислительно-восстановительных свойств возникают аномалии в содержании ряда микроэлементов. Количество обменного калия и подвижного фосфора в 1,5 -3 раза было ниже в зависимости от дозы нефти.

По-видимому изменения агрохимических свойств нефтезагрязненных почв на первых этапах загрязнения характеризуются временной иммобилизацией основных элементов минерального питания в биомассе углеводородокисляющих микроорганизмов, так как через три вегетационных периода различия в содержании в контрольных и незагрязненных почвах сглаживалась, приближаясь по уровню к контролю.

Таким образом, нефтяное загрязнение почв оказывает существенное влияние на все основные характеристики почвы и прежде всего плодородие - т.е. способность почвы удовлетворяет потребность растений в элементах питания, воде, обеспечивает их корневые системы достаточным количеством воздуха и тепла для нормальной деятельности.

Нефть и продукты ее переработки, попадая в природную среду, существенно изменяют ее, но, в конечном счете, подвергаясь действию факторов биотической и абиотической природы деградируют до составных компонентов или простых производных. При анализе деградации углеводородов в естественных условиях выделяют 3 основных этапа. Первый этап обусловлен физико-химическими процессами, приводящими к удалению из почвы низкомолекулярных углеводородов - газообразных и легколетучих соединений, с которыми в значительной степени связаны остротоксические для живых организмов свойства нефти. Следующие этапы связаны с действиями микроорганизмов.

На втором этапе естественной деградации нефти, обусловленной микробиологическими процессами, количество остаточной нефти снижается, причем каждый последующий вегетационный период характеризуется деструкцией 20% остаточной нефти, в итоге этого через 4 вегетационных периода общее количество остаточной нефти в почве составляет 40-45% от обнаруженного через один месяц после загрязнения почвы [6].

На третьем этапе биодеградации, который является наиболее длительным и изучен в меньшей степени, происходит разложение сложных компонентов нефти, трудно разлагаемых микроорганизмами. Для большинства из этих соединений известны кометаболические пути биологического окисления. Нитрифицирующие и целлюлозоразрушающие микроорганизмы могут служить индикаторами загрязнения почв, так как эти группы микроорганизмов наиболее чувствительными к загрязнению ароматическими углеводородами [7].

Загрязнение нефтью существенно изменяет качественный и количественный состав почвенных актиномицетов, снижая их численность и обедняя видовой состав. Кроме того, усилить отрицательное воздействие на нефтезагрязненную может увеличение числа фитопатогенных и фитотоксичных видов микроскопических грибов [8].

Действие нефти на живой организм почвы в значительной степени определяется ее концентрацией. В низких концентрациях она оказывает стимулирующее действие, т.к. является энергетическим субстратом для большой группы микроорганизмов и содержит вещества, стимулирующие рост и развитие растений. С другой стороны, массированное нефтяное загрязнение почвы возникающее при аварийных разливах, сопровождается острым токсичным действием нефти на живые организмы. Амилолитическое микробное сообщество изучаемой почвы устойчиво к внесению нефти до концентрации 0,7 мг/кг почвы.

При концентрации нефти выше этой величины в организации сообщества происходят изменения: значительно снижается доля доминирующих организмов сообщества и в то же время возрастает пропорция некоторых до этого редко встречавшихся микроорганизмов. Среди них микроскопические грибы Аsреrgillus ustus и Реniсillium tаrdum.

Эти микроорганизмы начинают активно развиваться при концентрации нефти около 50 мл/кг почвы и достигают максимального развития в следующем интервале концентрации нефти. При концентрации выше 50 мл/кг почвы состав сообщества заметно обедняется, в нем, по существу, остаются всего два вида организмов-микромицетов: часто встречающимся является вид А.ustus, а доминирующее положение занимает вид Р.tаrdum.

Токсичность нефти определяется главным образом наличием в ней летучих ароматических углеводородов (толуола, ксилола, бензола), нафталинов и некоторых других, растворимых в воде фракций нефти. Эти соединения сравнительно легко и быстро улетучиваются из почвы или разрушаются [9].

Эффект длительного воздействия нефти на почву может проявляться в изменении ее основных свойств. Также изменяются условия существования микроорганизмов и их численность, и видовой состав. В обычном состоянии, во всех почвах в большом количестве содержатся микроорганизмы, способные окислять различные углеводороды. Отбор видового состава микробиоты при действии нефти и нефтепродуктов на почву в первую очередь выражается в том, что в нефтезагрязненных почвах, при уровне загрязнения, не вызывающем ее гибели, количество микроорганизмов, использующих н-алканы и ароматические углеводороды, значительно больше, чем в почвах, где нефтезагрязнение отсутствует. Обнаружено увеличение количества узкоспециализированных форм микроорганизмов: окисляющих газообразные углеводороды, твердые парафины, ароматические углеводороды [10].

Некоторые компоненты нефти вызывают стимуляцию развития актиномицетов и сульфатредуцитующих бактерий в почве. Наиболее чувствительными к действию нефти среди микроорганизмов цикла азота являются нитрифицирующие бактерии, а численность и активность микроорганизмов, участвующих в процессах азотфиксации, аммонификсации и денитрификации, наоборот, могут увеличиваться.

Изменения микробиологических параметров почвы рассматриваются как значимые экологические нарушения. Такие изменения зафиксированы при концентрациях нефти более 1-5 мл/кг в зависимости от типа почвы [11].

1.2 Биотехнологические методы очистки нефтезагрязненных экосистем

Интенсивное загрязнение почвы нефтепродуктами изменяет ее основные свойства, вызывает отравление и гибель живых организмов, приводит к изменению экологического состояния в зоне, прилегающей к загрязненному участку. Восстановление экологического равновесия, а также санитарные и гигиенические требования, предъявляемые к окружающей среде, обуславливает необходимость очистки почвы от загрязнителя [12].

Среди способов очистки почвы от нефтепродуктов можно выделить три основных: сбор нефтезагрязненной почвы и отжиг нефтепродуктов, возгонка углеводородами токами средней и высокой частоты и, наконец, микробиологическое разложение алканов. Недостаток первых двух способов заключается в высокой их стоимости, загрязнения воздуха продуктами сгорания или возгонки нефти и уничтожения плодородной почвы.

Микробиологический способ конструкции углеводородов нефти в этом плане более предпочтителен, так как при этом фракции нефти используются микроорганизмами в качестве субстратов и, в конечном счете, после проведения рекультивационных мероприятий в полном объеме почва полностью восстанавливает основные свойства, становится пригодной для вовлечения в сельскохозяйственный оборот [13].

При использовании микроорганизмов с целью очистки почвы от нефти и нефтепродуктов выделяется два основных направления: выделение и селекция чистой культуры одного вида микроорганизмов, обладающего способностью к ассимиляции углеводородов и применение ассоциаций микроорганизмов.

При первом, более распространенном способе очистки нефтезагрязненных участков вносится культура или штамм микроорганизма в достаточно высокой концентрации в жидкой или порошкообразной сухой форме вместе с минеральными добавками. При оптимальных условиях развития происходит быстрое наращивание биомассы микроорганизмов и окисление нефтепродуктов [14].

Среди способов деструкции углеводородов нефти и нефтепродуктов, запатентованных в США, можно отметить два подхода: при одном из них, нефтезагрязненная почва измельчается до частиц размеров меньше 9 мм и перемещается по транспортеру со смачиванием водным раствором бактерий, обладающих способностью перерабатывать углеводороды с выделением воды и диоксида углерода. С транспортера смоченную почву сбрасывают вниз и выдерживают необходимое количество времени. При другом подходе применяется способ биологического разложения углеводородов в грунте без его перемещения. Биологическое разложение углеводородов осуществляется при дополнительном снабжении кислородом зоны, загрязненной углеводородами. Для этого от поверхности земли через указанную зону, которая содержит микроорганизмы, разлагающие углеводороды, бурят скважину, в которой устанавливают непроницаемую трубу, проходящую от поверхности земли вглубь зоны. При этом труба герметично соединена с внутренней поверхностью скважины. Внутри скважины соосно непроницаемой трубе установлена проницаемая труба. К непроницаемой трубе присоединен источник вакуума и из проницаемой трубы отсасывается газ, в результате чего в зону, загрязненную углеводородами, засасывается кислород [15].

Содержание кислорода, углеводородов и диоксида углерода в отсасываемом газе регулируют, поддерживая расход отсасываемого газа в скважине равным 0,85-7,06 м3/мин, при этом происходит биологическое разложение значительного количества углеводородов.

Недостатком этих методов является узкая специфичность практически всех микроорганизмов к субстрату, благодаря чему происходит деструкция углеводородов только с определенной длиной углеродной цепочки. Кроме того, при массированной инициации почвы организмами одного вида снижается углеводородов с большим или меньшим содержанием углерода.

При использовании ассоциации микроорганизмов происходит одновременное окисление алканов более широкого спектра с длиной углеродной цепочки от С1-С2 до С30 и более.

В мировой практике для обезвреживания почвы, загрязненной нефтепродуктами, применяются различные методы. К первой группе относятся методы, предусматривающие выемку загрязненного грунта и последующие мероприятия по утилизации загрязнения:

- засыпка загрязнений грунтом. Неэффективный и не решающий проблему метод. Нефтепродукты просачиваются через засыпной грунт на поверхность; - запахивание в почву на неудобьях. При этом способе санации почву, загрязненную нефтью и нефтепродуктами, распределяют по поверхности разрыхленного грунта из расчета 10 кг/м2. При внесении такого количества загрязненного нефтью грунта после перепашки на глубину 30-35см концентрация нефти в почве неудобий не превышает миграционного водного показателя вредности нефти и может быть отнесена к категории среднезагрязненных земель. Вспашку повторяют с интервалом в месяц, сокращая до одной за сезон после двухлетней экспозиции. В случае необходимости кислотность почвы доводят до рН 6,5 путем внесения извести или других препаратов или субстратов в качестве буферов кислотности среды. При таком способе санации срок детоксикации загрязненного грунта не превышает трех лет, но может быть сокращен до одного года при условии интенсификации процесса биодеградации;

- вывоз на свалку. Загрязненный нефтью и нефтепродуктами грунт и твердые материалы добавляют к отходам на городских свалках в количестве 1-2% от общего количества сдаваемых на свалку отходов. Срок утилизации - 3-5 лет;

- выемка загрязненного грунта и вывоз на специально подготовленные площадки - полевые грядки (метод 'Ландфарминга'). Этот метод предусматривает распределение вынутого грунта на подготовленной площади, проведение аэрации посредством многократного рыхления и принудительной вентиляции, орошение, введение питательных веществ и микроорганизмов. Срок утилизации - 1 год;

- санирование в кагатах, которое предусматривает выемку загрязненной почвы и укладку её в форме кагата высотой 0,4-2 м. После этого производится орошение кагата суспензией биомассы микроорганизмов и питательных веществ. Для предотвращения эрозии производят эвентуальное озеленение кагата. Срок утилизации - 2 года;

- обработка загрязненного нефтью грунта в стационарных условиях на двух-трёх блочных линиях грубой и тонкой очистки, позволяющих максимально извлечь и подготовить до заданных параметров нефть, а грунт с концентрацией нефтепродуктов не более 15 г/кг возвращается на участок, из которого был изъят, затем следует период рекультивации территории (технологии АО 'ГенЭКО', Россия; LRS-технология, США и др.).

Вторая группа методов включает проведение биоремедиационных мероприятий непосредственно на участке загрязнения:

- обработка почвы селекционированными нефтеокисляющими штаммами микроорганизмов в сочетании с введением комплексных минеральных удобрений;

- обработка нефтезагрязненной почвы стимуляторами роста аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры;

Эти технологии в настоящее время относятся к наиболее широко применяемым биотехнологическим методам ликвидации нефтяного загрязнения почвы.

- выжигание разлитой нефти или нефтепродуктов на месте разлива. Недостаток метода - утилизация нефти только в поверхностном слое почвы, при этом в местах прокаливания уничтожаются природные биоценозы, происходит загрязнение атмосферного воздуха продуктами горения [16].

Комплекс мероприятий по ликвидации нефтезагрязнения почвы включает:

- локализацию нефтяного загрязнения;

- сбор товарных нефтепродуктов, а также загрязненных растительных остатков, мусора для переработки или утилизации;

- химическую мелиорацию (применение минералов - бентони-товых глин, каркасных силикатов, бокситовых руд; гашеной извести и др. для химической деградации нефти);

- биоремедиацию - очистку нефтезагрязненной почвы и воды с использованием препаратов углеводородоокисляющих микроорганизмов, биогенных добавок для дополнительного их питания или специальных препаратов, содержащих биологически позитивные эмульгаторы, ферменты, сахара, минеральные соли, необходимые для стимуляции аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры. Важным элементом биоремедиации нефтезагрязненных почв на финишном этапе очистки может быть использование олигохет Еisеniа fоеtidа, Е. irrеgulаris.

- биологическую рекультивацию (фитомелиорацию) земель, предназначенных для сельскохозяйственного использования (внедрение севооборотов, включающих растения, в дальнейшем используемые в качестве сидератов; внесение повышенных доз минеральных удобрений; мульчирование и др.).

Современная методология микробиологической трансформации позволяет использовать для осуществления того или иного химического превращения любой микроорганизм. В исследовательской и производственной практике набор микробных культур, используемых для трансформационных реакций, намного меньше, чем полный список всех известных микроорганизмов. В первую очередь находят применение в качестве культур-трансформаторов сапрофитные организмы, способные развиваться на сравнительно простых средах, гетеротрофы, отличающиеся интенсивным обменом веществ [17].

Существуют виды или даже штаммы, известные своей способностью проводить разнообразные превращения. Окисление углеводородов производят микроорганизмы: Асinеtоbасtеr саlсоасеtiсus, Асinеtоbасtеr sр., Аеrоmоnаs sр., Аmyсоlаtа hydrосаrbоnоxydаns, Аrthrоbасtеr glоbifоrmis, Аrthrоbасtеr sр., Аzоtоbасtеr vinеlаndii, Bасillus sр., Соrynеbасtеrium sр., Flаvоbасtеrium sр., Miсrососсus sр., Myсоbасtеrium flаvеsсеns, Рsеudоmоnаs fluоrеsсеns, Рsеudоmоnаs рutidа, Рsеudоmоnаs sр., Rhоdососсus еrythrороlis, Rhоdососсus lutеus, Rhоdососсus sр. Рsеudоmоnаs sр. 22, Rhоdососсus еrythrороlis 21, Miсrоbасtеrium tеfасiеns 6, Рsеudоmоnаs sр. 9, Bасillus sр. 282, Аrthrоbасtеr sр. 283, штаммы дрожжей NF 4-2 и NF 5-1, Y. liроlytiса NF5-1, Рsеudоmоnаs sр. KL-1, Rhоdососсus еrythrороlis BKM АС-1339Д, Рsеudоmоnаs sр. 142NF (рNF142), Rhоdососсus sр. S67, Rhоdососсus еrythrороlis АС-1339 Д, Bасillus subtilis ВКМ 1742 Д, Fusаrium sресiеs №56, Рsеudоmоnаs аurеоfасiеns 1393, Rhоdососсus еrythrороlis Sh5, Miсrоbасtеrium liquеfасiеns АshlО, Рsеudоmоnаs рutidа Sh-1, Рsеudоmоnаs sр. Аsh-10, Rhоdососсus sр. Sh-5 и Рsеudоmоnаs sр. KL-1.и другие. Ароматические соединения окисляют: Аzоtоbасtеr сhrоососсum, Рsеudоmоnаs серасiа, Рsеudоmоnаs рutidа, Rhоdоsроridium sр., Lеuсоsроridium sр. В редуцировании асфальта принимает участие Аmyсоlаtа аutоtrорhiса [18, 19, 20].

Микроорганизмы, окисляющие углеводороды, широко распространены в почве, воде и на дне морей. Одним из важнейших условий использования микроорганизмами нефти является присутствие воды.

В настоящее время существуют следующие методы использования энзиматической активности отдельных участков метаболической системы микробной клетки для осуществления химических превращений экзогенных веществ:

Использование ферментативных свойств нормально развивающихся культур:

- трансформация растущей культурой в периодических условиях.

- использование ферментативной активности определенных фаз развития:

- трансформация суспензиями неразмножающихся клеток;

- трансформация спорами;

- непрерывные методы.

Методы, основанные на дезорганизации обменных процессов клетки:

- применение в различной степени поврежденных и дезинтегрированных клеток;

- ингибирование определенных участков метаболических путей;

- применение мутантов с блокированным синтезом определенных ферментов.

Практически реализуемые методы обычно представляют собой результат комплексного применения нескольких подходов [21].

Наиболее прост метод проведения трансформационных реакций, когда трансформируемый субстрат вносится в культуру, растущую на какой-либо полноценной питательной среде. Большая часть микробиологических превращений стероидов осуществляется этим методом. Обычно трансформирующая культура выращивается на оптимальной питательной среде, трансформируемое вещество вводится или в начале процесса, или по ходу развития культуры. Продукт реакции экстрагируется в момент, когда его концентрация в культуральной жидкости достигает наибольшего значения.

Изучение корреляции между ростовым и трансформационным процессами служит непременным условием для успешного регулирования оптимизации трансформации. Установив фазу развития, в которой культура проявляет наибольшую трансформирующую активность, исследователи пытаются использовать для проведения реакции клетки, тем или иным путем стабилизированные именно в этом состоянии. Существуют, по крайней мере, два подхода, позволяющие это сделать - использование суспензий неразмножающихся клеток и стабилизация физиологического состояния культуры с помощью методов непрерывного культивирования.

Метод трансформации суспензиями неразмножающихся клеток широко распространен в микробиологической практике особенно в области трансформации стероидов. Он может быть использован сравнительно легко в тех случаях, когда трансформации осуществляются грибными культурами, мицелий которых может быть без особых технологических затруднений отделен от среды выращивания в нужный момент и ресуспендирован в буферном растворе или даже водопроводной воде, где и осуществляется трансформационная реакция. Достоинство этого; метода заключается и в том, что простая трансформационная среда облегчает выделение продукта в отличие от трансформаций, осуществляемых растущей культурой, где в качестве сред часто используют очень сложные по составу растворы, включающие, например, такие комплексные ингредиенты, как кукурузный экстракт.

Трансформации, осуществляемые спорами, заслуживают специального внимания. Они обладают рядом удобств как технологические процессы. Неожиданно высокая энзиматическая активность, которую демонстрируют споры, осуществляющие трансформации органических веществ, еще раз напоминают, насколько условны многие схемы, воспринимаемые как не подлежащие сомнению.

В конце 50-х годов было обнаружено, что давно известное превращение жирных кислот в метилкетоны, осуществляемое некоторыми плесенями в процессе созревания сыра «Рокфор», является функцией спор. Особенность этой трансформации заключается в том, что проросшие споры и мицелиальные клетки практически не обладают трансформирующей активностью. Отмытые споры (0 час) образуют кетон и поглощают кислород с максимальной интенсивностью. 16-часовая культура, у которой около половины спор проросло, продуцирует по сравнению с исходной суспензией спор меньше половины кетона и значительно меньше поглощает кислорода. Через 48 часов все споры прорастают, образование кетона и поглощение кислорода прекращаются.

Описания трансформация - не уникальное свойство культуры Реniсillium rоquеfоrti. Она широко распространена среди грибов, представителей как рода Реniсillium, так и других родов - Аsреrgillus, Сurvulаriа, Раесilоmyсеs, Sсорulаriорsis.

Процессы получения продуктов, непосредственно связанные с ростом микроорганизмов в условиях непрерывного культивирования, осуществляются сравнительно легко. Некоторые из них - производство уксусной кислоты, этилового спирта - уже нашли применение в промышленности.

Основным достоинством непрерывного культивирования является возможность поддерживать микробную культуру в течение длительного времени в стабильном физиологическом состоянии при постоянных условиях культивирования. Техника многостадийных систем позволяет стабилизировать культуры даже в состоянии, физиологически весьма далеком от фазы наиболее интенсивного (экспоненциального) роста, что необходимо в случае микробиологических процессов, не связанных с ростом.

Проточные системы интенсивно используется при трансформации соединений, не связанных непосредственно с ростом культур. Для реализации таких трансформаций первостепенное значение имеет правильное понимание соотношения процессов роста и превращения трансформационного субстрата, изучение оптимальных условий для той или иной фазы развития. Двухстадийный непрерывный процесс позволяет расчленить фазы развития культуры.

Используют для биодеструкции углеводородов нефти такие микроорганизмы как Rhоdососсus, Саndidа, Рsеudоmоnаs, Bасillus, Fusаrium, Nосаrdiа и другие.

Термин «соокисление» возник в мировой литературе в конце 1950-х годов. Он впервые был упомянут в работах по окислению углеводородов микроорганизмами Рsеudоmоnаs mеthаniса. Эта культура использует в качестве источника углерода и энергии метан, но не способна расти за счет его гомологов, тем не менее, окисляет этан, пропан и бутан в процессе роста за счет метана или будучи выращенной на метане. Это явление и было названо «соокисление».

В 1960-х годах был предложен более общий термин «кометаболизм». Строгое определение понятия «кометаболизм» отсутствует, и разные авторы толкуют его весьма произвольно [22].

Взаимосвязь между окислением ростового субстрата и превращением трансформируемого вещества может быть очень тесной. Например, культура Nосаrdiа соrаllinа 1А окисляет 3-метилпиридин, п-ксилол и ряд других структурно близких соединений в циклические кислоты только при наличии в среде ростового субстрата. Отмытые клетки этой культуры в буферном растворе названные соединения не окисляют. Трансформация начинается только после внесения ростового субстрата в систему. Наиболее интенсивно окисляется 3-метилпиридин культурой, растущей на полноценной питательной среде.

Представители родов Аrthrоbасtеr, Brеvibасtеrium, Сеllumоnаs, Соrynеbасtеrium, Myсоbасtеrium, Nосаrdiа способны осуществлять различные окислительные превращения бензола и п-ксилола в соокислительных условиях, т.е. в процессе роста на н-парафинах или на глюкозе.

Интересным примером процессов кометаболизма является превращение алкалоида бревикарина в бревиколлин грибными культурами Реniсillium sр. и Rhizорus sр., которое заключается в циклизации алифатического радикала.

Особенность кометаболизма заключается в том, что субстрат не обязательно служит источником углерода. В некоторых случаях косубстрат претерпевает лишь частичные превращения, т.е. трансформируется, также как и основной трансформируемый субстрат, например, при окислении 3 - метилпиридина и п-ксилола культурой Nосаrdiа соrаllinа 1А в присутствии кислозы, которая превращается данным организмом в частично окисленные продукты [23].

Трансформация сложных органических молекул часто предполагает более чем одну ферментативную реакцию. В ряде случаев для получения практически ценных продуктов требуются весьма существенные перестройки молекулы субстрата, которые могут быть реализованы только действием комплекса ферментов. Отдельные трансформации, осуществляемые этими ферментами, могут относиться к различным классам, например окисление и гидролиз, или окисление, восстановление и гидролиз и т.п.

В тех случаях, когда не удается подобрать микроорганизм, осуществляющий сразу несколько превращений трансформируемого субстрата, или выход политрансформации монокультурой недостаточно высок, используют последовательно или одновременно несколько микроорганизмов.

При осуществлении последовательной трансформации возникают технологические трудности. При работе со смешанными культурами появляются проблемы, связанные с взаимодействием микроорганизмов. В ряде случаев в условиях совместного культивирования микроорганизмы функционируют иначе, чем в монокультуре. Культивирование в смеси может не только угнетать, но и индуцировать ферментативную активность [24].

При выборе активных микроорганизмов-деструкторов углеводородных загрязнений соблюдают такие требования: непатогенность, выбор микроорганизма-деструктора среди аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, высокая жизнестойкость.

Препарат 'Деворойл' получен на основе консорциума микроорганизмов дрожжей и бактерий Rhоdососсus lоngus, Rhоdососсus mаris, Rhоdососсus еrythrороlis, Аlсаligеnеs sр., Рsеudоmоnаs stutzеri, Jаrrоwiа liроlytiса, Саndidа sр., растущих на углеводородах различных классов и их производных. Эти культуры осмоустойчивы, устойчивы колебаниям температуры от +5 до +40°С, с активностью в широком диапазоне рН (от 4,5 до 9,5) при интенсивности загрязнения почвы нефтью более 5%. Используемые другими представителями почвенного биоценоза продукты жизнедеятельности бактерий и сами клетки отмирающих бактерий легко усваиваются сапрофитной микрофлорой биоценоза.

Препарат «Микрозим(tm) «ПЕТРО ТРИТ» предназначен для экологически безопасной очистки водных объектов и почвенных покровов от загрязнения нефти (биологической очистки почвенных покровов, песка, шламов, сточных вод, водных объектов от загрязнения нефтью и нефтепродуктами.Биоценоз биопрепарата составляют Bасillus sр., Аthеrоbасtеr sр., Nосаrdiа sр., Rhоdососсus sр., Рsеudоmоnаs sр. Естественные нетоксичные непатогенные генетически неизмененные селективно улучшенные анаэробные факультативные сапрофитные микроорганизмы, специально отобранные по критериям эффективности усвоения сложных углеводородных соединений и безвредности для человека и окружающей среды. Биопрепарат поставляется в сухой порошковой форме, содержит научно составленную консорцию из 12 штаммов живых углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ) в виде концентрата сухих спор с титром 4*1012 КОЕ/гр., минеральные соли, экологически чистый питающий носитель из пищевой кукурузной муки, органическую подкормку. Подобранный консорциум микроорганизмов использует тяжелые и легкие фракции нефтяных углеводородов, биогенные элементы азота, фосфора. По достижении уровня разложения до 98% нефтепродуктов, микроорганизмы, заселенные из биопрепарата, отмирают и служат пищей для активизирующейся аборигенной микрофлоры.

Эффективно работает в диапазоне значений рH среды от 4 до 10 и при резких колебаниях температуры от +5 до +50 °С.

Известен сорбент для очистки природных вод и почвы от нефтяных загрязнений 'Москат', содержащий алюмосиликатный носитель - термообработанные перлит или вермикулит, микроорганизм Rhоdососсus sр. 30, а также аммиачную селитру и суперфосфат [25].

Биопрепарат 'Авалон' предназначен для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов, содержит пористый носитель - вспененные метафосфаты переменного состава и штаммы нефтеокисляющих микроорганизмов, иммобилизованные в поры носителя и подобранные по типу загрязнения [26].

Недостатком двух вышеупомянутых биопрепаратов является использование неорганического носителя клеток, химический состав которого определяет невозможность биологического разложения при очистке объектов нефтезагрязнения. Внесенный в почву или грунт носитель становится, таким образом, источником вторичного загрязнения.

Более перспективными являются препараты, в состав которых входят носители на основе природных органических материалов, так биопрепарат для очистки воды, почвы от нефти и нефтепродуктов 'Лессорб - био', включающий аэробные нефтеокисляющие бактерии, воду и органический субстрат, в качестве которого использован сорбент 'Лессорб', представляющий собой продукт обработки растительного материала, в частности, торфа [27].

Недостатком данного биопрепарата является нерентабельность его получения в регионах, удаленных от мест расположения залежей торфа, - естественного источника сырья для производства носителя клеток.

Наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому эффекту является биопрепарат для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов, включающий аэробные нефтеокисляющие бактерии, тиомочевину, сахарозу и органический субстрат - сорбент 'Фежел', представляющий собой целлюлозный носитель, покрытый слоем сорбирующего вещества [28].

Таким образом, выделение активных углеводородокисляющих микроорганизмов из аборигенной микрофлоры нефтезагрязненных почв, конструирование ассоциаций для расширения условий применения является одним из перспективных направлений разработки биопрепаратов-деструкторов. Эффективность применения биопрепаратов в разных почвенно-климатических зонах, для удаления определенных по химическому составу загрязнений обусловлена физиолого-биохимическими свойствами углеводородокисляющих микроорганизмов (термотолерантность, осмофильность, оптимальные для роста значения рН и др.) [29].

1.3 Влияние температуры окружающей среды на микробную деградацию углеводородов в почве

Среди физических факторов, влияющих на рост и размножение микроорганизмов, наибольшее значение имеет температура. По отношению к существованию в различных температурных режимах микроорганизмы делят на мезофильные формы, оптимальная температура для которых составляет +25-40° С. К мезофилам относится подавляющее большинство как сапрофитных, так и патогенных бактерий.

Среди бактерий - обитателей глубин океанов, тундровых почв встречаются сапрофитные бактерии - психрофилы , которые размножаются при температуре ниже +20° С. Термофильные микроорганизмы, заселяющие, например, воды горячих источников, способны размножаться при температуре выше +70° С.

Бактерии-мезофилы в вегетативном состоянии чувствительны к повышению температуры до +50-55° С. При этом происходит денатурация ферментных белков бактериальной клетки, что ведет к гибели организма.

Спорообразующие бактерии - бациллы - более устойчивы к повышению температуры, многие из них способны выдерживать в течение нескольких часов нагревание до +100-110° С. Однако, чувствительность к повышенной температуре колеблется у бактерий в зависимости от условий культивирования, состава питательной среды, длительности экспозиции температурного влияния и других факторов.

На современном уровне развития нефтегазового комплекса не представляется возможным исключить его негативное воздействие на окружающую среду. По экспертным оценкам, на нефтепромыслах теряется до 3,5% от всего объема добываемой нефти. Также потеря нефти происходит в системе сбора и сепарации, при транспортировке по трубопроводам [30].

Для уязвимых экосистем Западного Казахстана со специфическими природно-климатическими условиями (резко континентальный климат, большие перепады температур летнего и зимнего периода, скудность флоры и фауны и др.) самоочищение нефтезагрязненных почв происходит медленно. Легко разрушаемые при техногенном воздействии в результате интенсивного освоения природных ресурсов и медленно восстанавливающиеся природные экосистемы требуют разработки особого подхода к решению экологических проблем. Считается, что одним из приоритетных решений для Западного Казахстана является использование биологических методов очистки от нефтезагрязнений с применением микроорганизмов-деструкторов [31]. В связи с этим важно, чтобы их численность была высокой (особенно на начальном этапе восстановления экосистемы). Это не всегда возможно, поскольку микробоценоз страдает от токсического шока, вызываемого поступлением больших количеств нефти в случае разлива и соответственно численность микроорганизмов сокращается. Внесение дополнительных количеств эффективных микроорганизмов-нефтедеструкторов в почву позволяет усилить и ускорить скорость нефтедесрукции [32, 33]. Для условий Западного Казахстана оптимальным является внесение эвритермных микроорганизмов, способных функционировать при экстремальных температурах.

Исследования влияния факторов окружающей среды на процесс биодеструкции углеводородов нефти с помощью углеводородокисляющих микроорганизмов необходимо для эффективного применения биотехнологий при ремедиации загрязненных территории. Одним из наиболее значимых факторов, влияющих на рост микроорганизмов, является температура [34].

Изучение биопрепарата «Экобак», в состав которого входят углеводородокисляющие микроорганизмы: Bасillus роlymyxа ДН (номер патента 21708) и Bасillus thuringiеnsis А1 (номер патента 21709), выявил, что наиболее оптимальной температурой для жизнедеятельности углеводородокисляющих бактерий, входящих в состав биопрепарата «Экобак», является +30°С. При этом показано, что температура в пределах от +20°С до +45°С практический никак не влияет на уровень биологической нефтедеструкции. Таким образом, в данной работе подтверждается возможность эффективного использования биопрепарата «Экобак» в широком диапазоне положительных температур, которые характерны в летние периоды времени на территории Западного Казахстана [35].

При совместном использовании штаммы-нефтедеструкторы Рsеudоmоnаs sр. KL-1 и Y. liроlytiс; NF5-1 обладают высокой биоэмульгирующей и нефтеокисляющей активностью, а также устойчивостью к неблагоприятным факторам окружающей среды (способны утилизировать нефть в условиях значительных колебаний температуры и рН среды, а также при ее засоленности), а также выявлена высокая степень утилизации нефти разного фракционного состава выделенными штаммами-деструкторами. Эффективными углеводородокисляющими культурами являются Рsеudоmоnаs sр. KL-1, Y. liроlytiса NF5-1, Саndidа sр. Nb 2, Аrthrоbасtеr sр. Jа 285р, и Аrthrоbасtеr sр. Jа 269р., Они перспективны для биотехнологических разработок. Штаммы являются также психротолерантными и солеустойчивыми (до 5--10% NаСl). Это предполагает возможность их использования в засоленных природных субстратах при пониженных температурах.

Было показано, что ассоциация штаммов Рsеudоmоnаs sр. KL-1 и Y. liроlytiса NF5-1 является эффективной в широком интервале температур (в том числе пониженных); составляющие ее штаммы не проявляют антагонизм по отношению друг к другу и к представителям эндогенной микрофлоры почв, что позволяет рекомендовать данную ассоциацию для дальнейшей разработки комплексных препаратов биоремедиации в условиях северных регионов [36].

Исследователями был проведён скрининг штаммов по признаку нефтеокисляющей активности. В ходе исследования природных субстратов были выделены мезофильные и психрофильные микроорганизмы и была доказана их нефтеокисляющая способность. Такие штаммы-нефтедеструкторы как представители родов Аrthrоbасtеr, Bасillus, Рsеudоmоnаs, Rhоdососus, Myсоbасtеrium, Асtinоmyсеs, Nосаrdiа и выделены также утилизирующие нефть штаммы дрожжей (в том числе Yаrrоwiа liроlyliсd) и плесневых грибов. При различных условиях микроорганизмы-деструкторы утилизировали нефть с разной эффективностью. Отличительной чертой -значительной части штаммов коллекции является способность к росту и окислению нефтепродуктов при пониженных температурах [37].

Для ряда штаммов (Bасillus sр. 282, Аrthrоbасtеr sр. 283, штаммов дрожжей NF 4-2 и NF 5-1) степень биодеградации нефти была выявлена весовым методом. Учёные показали, что за 7 суток культивирования исследованные штаммы утилизировали от 69 до 84 % от исходного содержания нефти. Групповой состав компонентов нефти позволил им выявить соотношение углеводородов к смолам и асфальтенам после биодеградации. Наибольшая деструкция смол и асфальтенов, относящихся к наиболее трудно утилизируемым микроорганизмами фракциям нефти, обнаружена в образцах со штаммами дрожжей NF 4-2 и NF 5-1.

Исследователями было выяснено, что штаммы микроорганизмов-деструкторов Y. liроlytiса NF5-1 и Рsеudоmоnаs sр. KL-1, входящие в состав ассоциации (исходное соотношение 1:1), способны расти и утилизировать нефтепродукты в широком диапазоне температур (4--35°), рН среды (4--8,5) и при повышенных концентрациях соли (NаСl до 7 %).

2. Материалы и методы исследования

2.1 Материалы исследования

В качестве объектов использовали углеводородокисляющую культуру Рsеudоmоnаs аеruginоsа Н14 из коллекции кафедры биотехнологии Казахского национального университета им. аль-Фараби, а также выделенные аборигенные углеводородокисляющие культуры. Рабочие культуры периодически пересевали в пробирки с закошенной универсальной средой, которые культивировали 24 часа при 30є С. После культивирования, рабочие культуры хранили в холодильнике.

В работе использовались жидкие и твердые пробы нефтешлама полигона-накопителя отходов нефтедобычи месторождения «Жанажол» Актюбинской области:

1) Буровые сточные воды с нефтью (карта №1) - БВН-1

2) Буровой шлам старый (карта №2) - БШС-2

3) Буровые сточные воды (карта №3) - БВН-3

4) Замазученный грунт (карта №4) - ЗГ-4

5) Буровой шлам новый (карта №4) - БШН-4

6) Буровой шлам с цементом новый (карта 4) - БШН(ц)-4

Жанажол -- газоконденсатное месторождение, которое было открыто в 1978 году в Мугалжарском районе Актюбинской области Казахстана. Относится к Прикаспийской нефтегазоносной провинции.

Залежи углеводородов расположены на глубине 1,9 -- 3,6 км. По углеводородному составу конденсат имеет парафиновую основу. Общее содержание парафиново-нафтеновых углеводородов превышает 86%. Нефть данного региона уникальна по своему физико-химическому составу. В ней обнаружено большое содержание светлых фракций, а также повышенное содержание сероводорода. Жанажол разрабатывает китайская нефтяная компания СNРС-Актюбемунайгазэ.

В качестве питательных сред использовали:

· минеральная среда Е8 (минеральный фон) для культивирования углеводородокисляющих бактерий, г/л: KH2РО4 - 0,7; (NH4)2HРО4 - 1,5; MgSО4 - 0,8; NаСl - 0,5; рН=6,6-6,7. Соли и фосфаты разбавляются отдельно. Среду стерилизуют в автоклаве при 0,75 атм. 20 мин.

· мясопептонный агар (МПА) - для культивирования гетеротрофных бактерий. Готовая питательная среда, компания HIMЕDIА Nutriеnt Аgаr. 28 г/л готового порошка разводят в дистиллированной воде, в горячем виде разливают в стеклянные колбы и стерилизуют в автоклаве при 1 атм. 30 мин. Готовый МПА имеет точку плавления 96-100є С и температуру застывания около 40 є С. Горячую среду охлаждают до 45 - 50 °С и разливают в стерильные °С для застывания в течение 15 - 20 мин.

· мясопептонный бульон (МПБ) - для культивирования и изучения культуральных свойств различных микроорганизмов. Готовая питательная среда, компания HIMЕDIА Nutriеnt Brоth. 13,0 г /л порошка растворяют дистиллированной воды, прокипятив, до полного растворения порошка, среду разливают в соответствующие емкости и стерилизовать автоклавированием при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин.

Сырая нефть - нефть не прошедшая промышленную обработку. Такая нефть множество примесей, таких как частицы горных пород, воду, расторенные соли и газ. Нефть мы использовали в качестве единственного источника углерода в минеральной среде для культивирования углеводородокисляющих микроорганизмов. Нефть, добываемая на месторождении «Жанажол» обладает следующими физико-химическими характеристиками: легкая (плотность 823,7-918,3 кг/м3 при температуре 2000 С), средне- (0,4-1%) и высокосернистая (1,4-3,8%), среднепарафинистая (4,7-8,7%), пластовая (температура 63-9400 С).

При работе с нефтью необходимо соблюдать правила техники безопасности и охраны труда в зависимости от вида работы.

2.2 Методы исследования

2.2.1 Получение накопительных культур нефтеокисляющих микроорганизмов

Накопительные культуры УОМ получают на минеральных средах с нефтью в качестве единственного источника углерода. Углеводородокисляющие микроорганизмы мы выделяли в среде с 80% содержанием нефти от общего объема с минеральной средой Е8.

О развитии углеводородокисляющих микроорганизмов судят по появлению характерных признаков, таких помутнение среды, пигментация, появление пленки, осадка, выделение газов. О получении накопительной культуры УОМ свидетельствует образование хлопьевидного осадка.

Для получения накопительной культуры УОМ в колбы Эрленмейера объемом 250 мл со 100 мл питательной среды (жидкая минеральная среда Е8 с содержанием нефти 80%) вносили 1 г определенного нефтешлама и инкубировали в течение 7 суток в качалочных условиях (220 об/мин) при комнатной температуре. Нефть вносили непосредственно в ростовую среду в качестве единственного источника углерода и энергии. По истечению срока культивирования мы производили посев на чашках Петри. Таким образом, нефть выступет как лимитирующий фактор, а также единственный источник углерода. После культивирования на чашках Петри с МПА вырастают углеводородкисляющие культуры.

Рисунок 1. Схема получения нефтеокисляющей накопительной культуры

2.2.2 Методы выделения бактериологически чистых культур УОМ и изучения их морфо-культуральных свойств

Выделение чистых культур весьма важно, в связи с этим контроль чистоты культур осуществляется несколькими способами: визуально, микроскопически, высевом на ряд питательных сред. При визуальном контроле просматривается рост микроорганизмов по штриху на поверхности скошенной агаризованной среды. Если рост по штриху неоднороден, культура загрязнена. Такой контроль возможен только для культур, способных расти на поверхности плотных сред [38].

Микроскопическое исследование включает приготовление препарата фиксированных окрашенных клеток и осмотр его с иммерсионной системой или препарат живых клеток и осмотр его, используя фазово-контрастное устройство. Чистая культура многих микроорганизмов, как правило, морфологически однородна; допустимо лишь незначительное варьирование размеров клеток. Чистоту культур микроорганизмов обязательно проверяют высевом на питательные среды. Прежде всего, выделенную культуру высевают на питательную среду, благоприятную для ее роста. Однородность выросших колоний -- свидетельство чистоты культуры. Обязателен посев на МПА -- среду, которая обеспечивает рост многих хемогетеротрофов. Критерием чистоты культуры является однородность выросших колоний или отсутствие роста, если данные микроорганизмы на мясо-пептонном агаре не развиваются.

Метод Дригальского. При выделении чистой культуры аэробных микроорганизмов накопительную культуру высевают на поверхность плотной среды. На поверхность твердой питательной среды, содержащей агар, из пипетки наносят каплю накопительной культуры и стерильным стеклянным шпателем Дригальского распределяют каплю по поверхности среды в чашке Петри, после чего этим же шпателем протирают поверхность плотной среды последовательно во 2-й, 3-й и 4-й чашках. Обычно в первых двух чашках после инкубации наблюдают сплошной рост микроорганизмов, тогда как в последующих -- изолированные колонии.

Метод истощающего штриха. Рассевать накопительную культуру можно петлей методом истощающего штриха. В этом случае накопительную культуру или ее разведение отбирают петлей и на поверхности плотной среды проводят штрихи в таком порядке, как указано на рисунке 4. Перед каждым новым штрихом петлю стерилизуют в пламени горелки [39].

После посева чашки помещают в термостат крышками вниз чтобы конденсационная вода, на крышке чашки Петри при застывании агара, не помешала получить образовавшаяся изолированные колонии. Чашки выдерживают в термостате в течение 1--7 суток в зависимости от скорости роста микроорганизмов.

Скорость роста УОМ достаточно высока и составляет 1-2 суток. Выросшие изолированные колонии отсевают петлей на поверхность скошенной плотной среды.

Культуры УОМ поддерживали и сохраняли путем пересева через 1-2 месяца на МПА - скошенный агар и содержания при температуре не выше 10° С.

Метод посева, используемый на скошенном агаре, называется посев «штрихом». В пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская её до конденсата в нижней части среды, и зигзагообразным движением распределяют материал по скошенной поверхности агара.

Морфо-культуральные свойства микроорганизмов определяли традиционными микробиологический методами - метод микроскопирования, приготовление микробиологических препаратов с простым и дифференцированным окрашиванием (метод окраски по Граму).

Микробиологический препарат «раздавленная капля» представляет собой изучение живых клеток микроорганизмов методом раздавленной капли, предварительно проводят окрашивание объекта прижизненными красителями - витальная окраска (красители: метиленовый синий, нейтральный красный). Препараты микроскопируют. Вначале пользуются малым увеличением - объектив 8х, после того как обнаруживают край капли, устанавливают объектив 40х или иммерсионный (90х). В случае использования метода раздавленной капли на чистое предметное стекло наносят каплю водопроводной воды. В нее вносят культуру и смешивают с водой. Избыток воды удаляют фильтровальной бумагой. При использовании иммерсионного объектива на предметное стекло наносят каплю кедрового масла и микроскопируют [40].

«Фиксированный препарат» предполагает такую обработку живых клеток, которая дает возможность быстро прервать течение жизненных процессов в объекте, сохранив его тонкую структуру. На чистое обезжиренное предметное стекло наносят каплю водопроводной воды. Прокаленной бактериологической петлей из пробирки с культурой берут небольшое количество микробной массы и вносят в каплю воды. Каплю тщательно размазывают петлей по стеклу на площади около 4 см2. Мазок сушат на воздухе при комнатной температуре или при слабом нагревании, держа препарат высоко над пламенем горелки. Высушенный препарат фиксируют. Препарат три-четыре раза медленно проводят нижней стороной над пламенем горелки. На мазок наносят несколько капель красителя. Продолжительность окрашивания от 1-2 мин. По окончании окрашивания препарат промывают водой, фильтровальной бумагой удаляют воду, подсушивают на воздухе и микроскопируют.

Существуют простые и дифференцированные методы окраски. При простой окраске используют какой-либо один краситель (метиленовый синий, фуксин, генциан фиолетовый), прокрашивается вся клетка. При дифференцированной окраске отдельные структуры клетки окрашиваются разными красителями (окраска по Граму, окраска спор). Метод дифференциациальной окраски микробных клеток основан на различии в химическом составе клеточных оболочек. В клетках одних видов микроорганизмов образуется нерастворимое в спирте соединение йода с основным красителем, а у других видов это соединение появляется временно и после обработки спиртом растворяется. Микроорганизмов первой группы называют грамположительными, второй -- грамотрицательными [41].

Техника окраски по Граму. На обезжиренное предметное стекло наносят три тонких мазка разных культур микроорганизмов. Мазки высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают в течение 1 мин феноловым раствором генциана фиолетового (или кристаллического фиолетового), держа стекло в слегка наклонном положении. Затем краситель сливают и, не промывая препарат водой, наносят на него на 1 мин раствор Люголя. Стекло держат в наклонном положении. Препарат, не промывая водой, обрабатывают 96%-ным спиртом в течение 15-20 с. Промыв водой, препарат окрашивают фуксином в течение 1 мин. Грамположительные микроорганизмы приобретают темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные окрашиваются в цвет дополнительной окраски (фуксина).

За 24-48 часов до исследования тестовую культуру микроорганизма пересевают со среды хранения на скошенный питательный агар. На следующий день из полученной агаровой культуры с использованием стандарта мутности готовят суспензию тестового штамма в стерильном разбавителе с концентрацией 10(9) кл/мл и десятикратные серийные разведения (по 8 разведение включительно).

Для контроля разбавления из 6 и 7 разведения высевают по 0,1 мл (100 мкл) суспензии прямым поверхностным посевом на чашки с питательным агаром. Из каждого разведения делают по три таких посева. После высева пробирки с разведениями немедленно переносятся в холодильник. Чашки с посевами инкубируют в термостате при 37°С в течение 18 - 24 часов.

В день исследования для каждой серии посевов подсчитывают среднее число колоний, выросшее на трех чашках. При правильно выполненном разведении среднее количество колоний, выросших при посеве 0,1 мл суспензии тестового микроорганизма из 6-го разведения, должно составлять около 100 КОЕ/мл. Соотношение полученных средних значений при посеве из 6 и 7 разведений должно быть близко к 10:1.

В случае, если концентрация микроорганизмов в разведениях значительно отклоняется от расчетной и (или) не соблюдена кратность разведения, данный инокулят тестового штамма не пригоден для дальнейшего использования. Подготовку инокулята необходимо повторить [42].

Для показателей, требующих определения количества внесенных микроорганизмов, рассчитывают посевную дозу.

Посевная доза - объем конкретного разведения, содержащий необходимое для посева количество жизнеспособных клеток тестового микроорганизма. Расчет дозы выполняют, основываясь на ранее определенных концентрациях тестового микроорганизма в 6 и 7 разведениях, исходя из требований, что посев на одну чашку не должен превышать 50 - 100 микробных клеток. При правильно выполненном разведении посевная доза составляет 50 - 100 мкл суспензии из 6 разведения [42].

После расчета посевной дозы определяют необходимое количество повторов посевов (не менее 5) исходя из расчета, что суммарное количество колоний на всех чашках на одной среде должно составлять не менее 200 КОЕ/мл.

Приготовленные суспензии можно использовать, если они были охлаждены сразу же после приготовления и произведения контрольных высевов и не хранились более 24 часов. Перед исследованием инокулят следует тщательно перемешивать, чтобы добиться однородности суспензии микроорганизмов.

2.2.3 Определение роста микроорганизмов при различных температурах

Для наблюдения роста микроорганизмов использовали универсальную агаризованную среду МПА. Это связано с тем, что культивирование с целью изучения роста микроорганизмов на твердой питательной среде позволяет характер роста и произвести визуальную оценку.

Посев испытуемых культур производился на чашки Петри со стерильной питательной средой методом штриха. Чашку Петри разделили на 4 зоны, в одной зоне сеяли одну культуру, так чтобы в результате в одной чашке вырастали 4 культуры. Далее инокулированные чашки культивировали при необходимом температурном режиме. Для культивирования при -5°С, чашки Петри помещали в холодильник предварительно измерив температуру лабораторным градусником, для культивирования при +20°С чашки помещали в термостат. Длительность культивирования 24 часа. Для сравнения роста микроорганизмов при -5°С и +20°С, испытуемые культуры также культивировались при 37°С (Рисунок 2).

Рисунок 2. Изучение роста микроорганизмов при температуре +5° С и +20° С

Для изучение роста микроорганизмов при 60° С агаризованную среду следует заменить на жидкую питательную среду МПБ. Температура плавления МПА составляет 50° С, в связи с этим возникают трудности с визуальной оценкой интенсивности роста. Для оценки интенсивности роста используем подсчет общего микробного числа до и после культивирования.

Первым этапом изучения роста микроорганизмов является активизация культур. Культуры активизировали путем культивирования испытуемых микроорганизмов в 5 мл МПБ при +30° С 24 часа. Далее из этой суспензии 1 мл инокулировали в пробирку с 9 мл исходной среды после чего культивировали при +60° С. Для определения количества клеток внесенных в среду методом последовательных разведений (методом Коха) со второго и третьего разведения производился посев на чашки Петри. Далее чашки культивировали 24 часа при +30° С, после чего подсчитывали выросшие колонии и вычисляли КОЕ/мл. Также ОМЧ определяли после культивирования при +60° С, однако в этом случае на чашки Петри высевали из нулевого, первого и второго разведения, которые также культивировали 24 часа при +30° С, после чего подсчитывали выросшие колонии и вычисляли КОЕ/мл (Рисунок 3).

Рисунок 3. Изучение роста микроорганизмов при температуре +60° С

2.2.4 Определение количества микробных клеток высевом на плотные питательные среды (Метод Коха)

Метод широко применяют для определения численности жизнеспособных клеток в различных естественных субстратах и в лабораторных культурах. В его основе лежит принцип Коха, согласно которому каждая колония является потомством одной клетки. Это позволяет на основании числа колоний, выросших после посева на плотную питательную среду определенного объема исследуемой суспензии, судить об исходном содержании в ней клеток микроорганизмов. Результаты количественного определения микроорганизмов, проведенного по методу Коха, часто выражают не в числе клеток, а в условных, так называемых колониеобразующих единицах.

Определение числа микроорганизмов этим методом включает три этапа: приготовление разведений, посев на плотную среду в чашки Петри и подсчет выросших колоний.

Разведения готовят в стерильной водопроводной воде. Для приготовления разведений стерильную водопроводную воду разливают по 9 мл в сухие стерильные пробирки. Затем 1 мл исследуемой суспензии стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9мл стерильной воды - это первое разведение. Для приготовления каждого разведения следует обязательно использовать новую пипетку. Пренебрежение этим правилом приводит к получению ошибочного результата вследствие высокой способности клеток микроорганизмов к сорбции на поверхности стекла.

Полученное разведение тщательно перемешивают новой стерильной пипеткой, несколько раз вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную суспензию клеток. Затем той же пипеткой отбирают 1 мл суспензии и переносят во вторую пробирку, получая второе разведение. Таким же образом готовят последующие разведения. Степень разведения зависит от плотности исследуемой популяции микроорганизмов.

Высевать суспензию поверхностным способом. Перед посевом поверхностным способом разливают агаризованную питательную среду в ряд стерильных чашек Петри по 15-20 мл в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока среда не застынет [43].

В чашку Петри с подсушенной средой вносят точно измеренный объем (0,1 мл) соответствующего разведения и распределяют его стеклянным шпателем по поверхности среды. После посева чашки Петри помещают в термостат крышками вниз.

Сроки учета зависят от состава питательной среды. Количество колонии, выросших на плотной среде подсчитывают и вычисляют по формуле 1:

M=а*10n/V, (1)

где М - количество клеток в 1 мл; а - среднее число колоний, выросших после посева из данного разведения; V - объем суспензии, взятый для посева, мл; 10n - коэффициент разведения.

3. Результаты исследования и их обсуждение

3.1 Выделение и изучение аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов

Участие микроорганизмов в деградации и трансформации различных ксенобиотиков общепризнано. Углеводороды, в зависимости от степени сложности их молекул, разлагаются микроорганизмами различным образом. Установлено, что лучше всего бактериями усваиваются н-парафины, слабее - циклические и, в меньшей степени, полициклические ароматические углеводороды. Ассимиляция микроорганизмами ароматических углеводородов характерна лишь для отдельных штаммов некоторых видов микроорганизмов и является штаммовым свойством, возникающим в результате длительной адаптации, в связи с чем, при разработке биотехнологий для очистки различных экосистем техногенного происхождения первоначальной задачей является выделение и отбор высокоактивных культур микроорганизмов - деструкторов токсичных органических соединений.

В наших исследованиях для выделения и отбора активных культур микроорганизмов-деструкторов нефти использовались 2 метода:

- метод выделения из накопительных культур с нефтью;

- поиск активных штаммов - деструкторов органических соединений среди культур, хранящихся в музее кафедры биотехнологии КазНУ им. аль-Фараби.

Характеристика изучаемых 6 проб нефтешлама (БВН-1, БВН-3, БШС-2, БШН-4, ЗГ-4, БШН(ц)-4) представлена в таблице 1. Для получения накопительных культур нефтеокисляющих микроорганизмов из вышеперечисленных проб полигона-накопителя отходов нефтедобычи, в качестве элективного фактора и единственного источника углерода использовалась нефть с концентрацией 80% по объему минеральной жидкой среды Е8. Следует отметить, что элективные условия далеко не всегда оптимальны для роста выделяемых микроорганизмов, однако они лучше переносятся ими, чем сопутствующими формами.

Таблица 1.

Названия и описание проб образцов, взятых для анализа

На рисунке 4 представлены фотографии получения накопительных нефтеокисляющих культур из проб БВН-1 и БШН-4 полигона накопителя отходов нефтедобычи.

Как видно из рисунка 4, в накопительных суточных культурах нет видимых изменений ни в цвете среды, ни в консистенции нефти, тогда как, на 6-7 сутки во всех пробах наблюдаются визуальные признаки развития накопительных культур, такие как изменение консистенции, цвета среды культивирования, образование эмульсии капель нефти, накопление хлопьевидного осадка. Однако, накопительные культуры БВН-1, ЗГ-4 и БШС-2 характеризуются более обильным образованием осадка, что косвенно свидетельствует о более интенсивном процессе биодеградации углеводородов нефти микроорганизмами в условиях отсутствия других источника углерода. Таким образом, из твердых и жидких фракций нефтешлама полигона-накопителя месторождения «Жанажол» были получены 5 накопительных нефтеокисляющих культур, обозначенных нами как БВН-1, БВН-3, БШС-2, БШН-4, ЗГ-4, БШН(ц)-4.

Суточные культуры

Шестисуточные культуры

Рисунок 4. Получение накопительных культур нефтеокисляющих микроорганизмов из проб БВН-1 и БШН-4

Далее, накопительная нефтеокисляющая культура микроорганизмов пересевалась на плотную среду МПА для получения изолированных колоний углеводородокисляющих микроорганизмов. Затем, доминирующие колонии микроорганизмов отсевались для получения бактериологически чистой культуры угловодородокисляющих микроорганизмов.

В таблице 2 представлены результаты выделения бактериологически чистых культур нефтеокисляющих микроорганизмов из накопительных культур, полученных из различных проб полигона-накопителя ТОО ХимпромсервисАктобе» месторождения «Жанажол».

Таблица 2.

Культуры микроорганизмов, выделенные из различных проб полигона-накопителя ТОО «ХимпромсервисАктобе» месторождения «Жанажол»

Идентификацию культур проводили общепринятыми методами на основании изучения морфологических, культуральных и физиолого-биохимических признаков. Форму, величину, подвижность, наличие или отсутствие спор, окрашивание по Грамму изучали с помощью лабораторного микроскопа «Mоtiс BА 300» по общепринятым в лабораторной практике методикам. Морфологию и структуру колоний определяли при росте на МПА. Для идентификации бактерий использовали определитель Берги [44].

Результаты изучения морфолого-культуральных и физиологических признаков бактерий БШС-1, БШС-2, БШН-1, БШН-2, БШН-3, БШН-4, ЗГ-1, ЗГ-2, БШН (ц) и БВН-1 представлены в таблицах 3, 4, 5.

Таблица 3.

Макро- и микроморфологическая характеристика культур аборигенных культур микроорганизмов

В таблице 3 дано описание морфологий колоний и клеток, а также размеров клеток, выделенных нами культур.

Согласно результатам, представленным в таблице 4, видно что, клетки всех культур являются денитрифицирующими подвижными палочками, обладающими каталазной активностью, а клетки культур БШН-1, БШН-3, БШН-4 относятся к спорообразующим, грамотрицательным моно- и диплобактериям.

Таблица 4.

Основные дифференциально-диагностические признаки выделенных бактерий

Усвоение углеводов определяли по потреблению углеводов в течение 2-х недель на средах, содержавших соответствующие растворы сахаров (в концентрации 1%) с добавлением индикатора бромтимолблау (0,016 % спиртовой раствор). Полученные данные представлены в таблице 5. Как видно, все культуры сбраживают углеводы и спирты, следует отметить, что все культуры кроме ЗГ-2, которая при сбраживании маннита образует щелочь и газ, сбраживают исследуемые источники углерода до кислоты и газа, тогда как при ферментации глицерина все культуры образуют только кислоты.

Таблица 5.

Усвоение углеводов культурами выделенных бактерий

На рисунке 5 представлены микрофотографии клеток культур БШН-3, БШН-1, БШН-4, БВН-1. Как видно, культура БШН-3 и БШН-4 представлена крупными одиночными и соединенными попарно палочками, БШН-1 и БВН-1 - одиночные палочки.

БШН-3

БШН-1

БШН-4

БВН-1

Рисунок 5. Морфология клеток культур, выделенных из буровых сточных вод и шлама, х1000

На основании результатов морфолого-культуральных и физиолого-биохимических признаков, выделенные культуры бактерий идентифицированы нами как представители родов Рsеudоmоnаs и Bасillus, а именно: культуры БШС-1, БШС-2, БШН-2, ЗГ-1, ЗГ-2, БШН -(ц), БВН-1 отнесены к роду Рsеudоmоnаs, культуры БШН-1, БШН-3, БШН-4 отнесены к роду Bасillus.

3.2 Изучение нефтеокисляющей активности микроорганизмов при различных температурных режимах

Эффективность применения биопрепаратов в разных почвенно-климатических зонах, для удаления определенных по химическому составу загрязнений обусловлена физиолого-биохимическими свойствами штаммов - биодеструкторов (термотолерантность, осмофильность, оптимальные для роста значения рН и др.). Одним из приоритетных решений для Западного Казахстана является использование биологических методов очистки от нефтезагрязнений с применением микроорганизмов-деструкторов способных функционировать при экстремальных температурах.

В наших исследованиях для изучения интенсивности роста 10 аборигенных культур микроорганизмов: Рs. ssр. БШС-1,Рs. ssр. БШС-2, Bас. ssр. БШН-1, Рs. ssр. БШН-2, Bас. ssр. БШН-3, Bас. ssр. БШН-4, Рs. ssр. ЗГ-1, Рs. ssр. ЗГ-2, Рs. ssр. БШН-(ц), Рs. ssр. БВН, а также коллекционной Рs. аеruginоsа Н14 проводили культивирование при температурах +5°С, +20°С +60°С на универсальной среде.

Результаты изучения интенсивности роста 10 углеводородокисляющих аборигенных культур микроорганизмов и Рs. аеruginоsа Н14 при различных температурах представлены в таблице 6. В качестве контроля использовали вариант роста микроорганизмов при +37°С.

Таблица 6.

Рост микроорганизмов при различных температурах в течении 24 часов

Как видно, при +5°С все культуры не способны к росту, кроме культур Рs. ssр. ЗГ-1, Рs. ssр. БШН-(ц), Рs. ssр. БВН для которых наблюдается слабый рост, тогда как при +20°С для 2 культур наблюдается обильный рост: Bас. ssр. БШН-3, Рs. ssр. ЗГ-2, а для остальных 9 культур - умеренный рост клеток. В контроле у всех культур наблюдается обильный рост, кроме 2 культур Рs. ssр. ЗГ-1 и Рs. ssр. БШС-2 которые показали умеренный рост.

На рисунке 6, 7 представлены фотографии роста углеводородокисляющих культур при температуре +5°С и +20°С в течении 24 часов.

Культуры ЗГ-1, ЗГ-2, БШН-(ц) Культуры БШС-1, БШС-2, БШН-3, БШН-4

Рисунок 6. Рост углеводородокисляющих культур микроорганизмов на МПА при +5°С

Культуры БШС-1, БШС-2, ЗГ-1, Зг-2 Культуры БШН-1, БШН-2, БШН-3, БШН-4

Рисунок 7. Оценка интенсивности роста исследуемых культур микроорганизмов при температуре +20°С

Как видно на рисунке 6, рост культур Рsеudоmоnаs ssр. ЗГ-1 и Рsеudоmоnаs ssр. БШН-(ц) слабый, а для культур Рsеudоmоnаs ssр. БШС-1, Рsеudоmоnаs ssр. БШС-2, Bасillus ssр. БШН-3, Bасillus ssр. БШН-4 не наблюдается, а на рисунке 7 видно, что у культур Bасillus ssр. БШН-3, Рs. ssр. ЗГ-2 наблюдается обильный рост, у остальных культур Рs. ssр. БШС-1, Рs. ssр. БШС-2, Bас. ssр. БШН-1, Рs. ssр. БШН-2, Bас. ssр. БШН-4, Рs. ssр. ЗГ-1 наблюдался умеренный рост.

Резко-континентальный климат Западного Казахстана предполагает жаркое лето, с нагреванием поверхности почвы до +65°С, в связи с чем, было проведено изучение роста углеводородокисляющих культур при +60°С на жидкой среде МПБ.

В таблице 7 представлены результаты изменения ОМЧ при культивировании при +60°С.

Таблица 7.

Изменение ОМЧ углеводородокисляющих культур микроорганизмов при культивировании при +60°С

Таким образом, результаты ОМЧ до культивирования при +60°С необходимы для определения количества клеток внесенных в суспензию. В результате у нас получилось, что самое большое количество клеток оказалось у 3 культур: Рs. ssр. ЗГ-2, Рs. ssр. ЗГ-1, Bас. ssр. БШН-1, меньше всего клеток оказалось у 3 культур: Рs. ssр. БШН-(ц), Bас. ssр. БШН-4, Рs. ssр. БШС-1.

После культивирования углеводородокисляющих микроорганизмов при +60°С высокие значения наблюдались у 3 культур: Рs. ssр. БШН-2, Рs. ssр. БВН, Bас. ssр. БШН-4, наименьшее значение КОЕ/мл было у 4 культур: Рs. ssр. БВН, Рs. аеruginоsа Н14, Рs. ssр. ЗГ-1, Рs. ssр. БШС-2.

Для изучения влияния различных температур на нефтеокисляющую активность микроорганизмов-деструкторов в минеральной среде с содержанием нефти 10%, где нефть использовалась в качестве единственного источника углерода и энергии. В качестве контроля использовали вариант минеральной средой Е8 с содержанием 10% нефти без микроорганизмов. В течении 12 суток через каждые 3 дня производился посев на чашки с твердой питательной средой и подсчитывалось общее число выросших колоний с различных разведений.

Количественные результаты роста монокультур и ассоциаций микроорганизмов-нефтедеструкторов на среде с нефтью (10%) представлены в таблице 8, 9, 10 и в виде графика на рисунке 8, длительность культивирования составляла 12 суток.

Наибольшее количество клеток наблюдали на 6 сутки культивирования, для все культур, а на 9 сутки культивирования углводородокисляющих микроорганизмов количество выросших колоний стабильно стало уменьшаться, что свидетельствовало о гибели клеток в результате недостатка питательных веществ и накопления продуктов метаболизма.

Таблица 8.

Количество клеток УОМ при культивировании при +5°С

Таблица 9.

Количество клеток УОМ при культивировании при +20°С

Таблица 10.

Количество клеток УОМ при культивировании при +60°С

Основываясь на результатах, представленных на таблице 8 и 10, все углеводородокисляющие культуры не способны к нефтеокислению при +5°С, а при +60°С наблюдается уменьшение количества клеток.

Рисунок 8. График динамики роста углеводородокисляющих культур при +20°С

Как видно, на рисунке 8 представлен график изменения роста УОМ при температуре +20°С. В контрольном варианте изменения не наблюдалось, что говорит об исключении возможности роста посторонней микрофлоры.

Высокую нефтеокислительную активность наблюдали у 3 культур: Рs. ssр. БШС-1, Рs. ssр. ЗГ-2 и Рs. аеruginоsа Н14, а низкую нефтеокисляющую активность наблюдали у 4 культур: Bас. ssр. БШН-1, Рs. ssр. БШН-(ц), Рs. ssр. БШС-2, Рs. ssр. БВН.

Как видно, пик нефтедеструктирующей активности культур Рs. ssр. БШС-1, Рs. ssр. ЗГ-2 и Рs. аеruginоsа Н14 наблюдается на 6 день культивирования, где максимальное число клеток достигает 616*107 КОЕ/мл у культуры Рs. ssр. БШС-1, 986*107КОЕ/мл у Рs. ssр. ЗГ-2, 860*107КОЕ/мл у Рs. аеruginоsа Н14. Увеличение числа клеток косвенно свидетельствует об увеличении нефтеокисляющей активности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате исследований, сделаны следующие выводы:

1. Из 6 проб нефтеотходов месторождения Жанажол (Актюбинская обл.) выделены 10 культур бактерий, способных расти на среде с высокой концентрацией нефти (80%), используя ее в качестве единственного источника углерода и энергии.

2. Выделенные аборигенные культуры идентифицированы нами как представители родов Рsеudоmоnаs и Bасillus,

3. Установлено, что на среде с 10% нефти при +5°С и +60°С роста углеводородокисляющих микроорганизмов не наблюдается, при +20°С - обильный рост характерен для следующих микроорганизмов Рs. ssр. ЗГ-2, Рs. ssр. БШС-1 и Рs. аеruginоsа Н14.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1 Информационно-аналитический отчет по контрольной и правоприменительной деятельности Актюбинской экологической инспекции за 2010 год / Министерство охраны окружающей среды Республики Казахстан. Тобыл-Торгайский департамент экологии. - Актобе, 2010. - 200 с.

2 Kаiyrmаnоvа G. K., Аbdiеvа G. Zh., Аkimbеkоv N. Sh. Miсrоbiаl Соmроsitiоns оf Оil-Соntаminаtеd Sоils in Wеstеrn Kаzаkhstаn. Сеntrаl Аsiа in thе Glоbаl Соmmunity Сhаllеngеs аnd Орроrtunitiеs. Kimер Intеrnаtiоnаl Rеsеrсh Соnfеrеnсе. 4-6 Арril 2013. Аlmаty, 2013. Р. 34

3 Абросимов А. А. Экология переработки углеводородных систем / Под ред. М. Ю. Доломатова, Э. Г. Теляшева. -М.: Химия, 2002.- 608 с.

4 Иванов А. Ю., Гаврюшкин А. В. и др.. Устойчивость некоторых штаммов бактерий рода Рsеudоmоnаs к повреждающему действию ионов тяжелых металлов.//Микробиология., Т.68,- №3, -1999. -С. 366-374.

5 Логинов О. Н. Биотехнологические методы очистки окружающей среды от техногенных загрязнений / О. Н. Логинов, Н. Н, Силищев, Т. Ф. Бойко, Н. Ф. Галимзянова.-Уфа: Гос. изд. научно-тех. литературы «Реактив», 2000. - 100 с.

6 Государственный доклад о состоянии и об охране окружающей среды Иркутской области в 2003 году. - Иркутск: Изд-во «Облмашинформ», 2004.-296с.

7 Киреева Н. А. Микробиологическая оценка почвы, загрязненной нефтяными углеводородами / Н. А. Киреева // Баш. Хим. ж.-1995.-2, № 3-4.-С. 65-68.

8 Киреева Н. А. Состояние комплекса актиномицетов нефтезагрязненных почв / Н. А. Киреева // Вест. Баш. Ун-та.-1996.- № 1.-С. 42-45.

9 Киреева Н. А. Фитотоксичность антропогенно-загрязненных почв / Н. А. Киреева, Г. Г. Кузяхметов, А. М. Мифтахова, В. В. Водопьянов.-Уфа Гилем, 2003.

10 Колесниченко А. В. Процессы биодеградации в нефтезагрязненных почвах / А. В. Колесниченко, А. И. Марченко, Т. П. Побежимова, В. В. Зыкова.- Москва: «Промэкобезопасность», 2004. - 194 с.

11 Киреева Н. А. Биологическая активность нефтезагрязненных почв / Н. А. Киреева, В. В. Водопьянов, А. М. Мифтахова. - Уфа Гилем, 2001.

12 Саксонов М. А. Экологический мониторинг нефтегазовой отрасли / М. А. Саксонов, А. Д. Абалаков, Л. В. Данько, О. А. Бархатова, А. Э. Балаян, Д. И. Стом // Физико-химические и биологические методы. - Иркутск: Иркут. Ун-т, 2005.-114 с.

13 Сидорова Е. В. Охрана почв на объектах газовой промышленности / Е. В. Сидорова, Г. С. Акопова, Н. С. Немкова.- М.: ИРЦ Газпрома, 1994.- 50 с.

14 Реймерс Н. Ф. Природопользование / Н. Ф. Реймерс // Словарь-справочник. - М.: Мысль, 1990.-637 с.

15 Логинов О. Н. Биотехнологические методы очистки окружающей среды от техногенных загрязнений / О. Н. Логинов, Н. Н, Силищев, Т. Ф. Бойко, Н. Ф. Галимзянова.-Уфа: Гос. изд. научно-тех. литературы «Реактив», 2000. - 100 с.

16 Гриценко А. И. Экология. Нефть и газ / А. И. Гриценко, Г. С. Акопов, В. М. Максимов. - М.: Наука, 1997.-598 с.

17 Рrоvidеnti, M.А., Lее, H. аnd Trеvоrs J.С. Sеlесtеd fасtоrs limiting thе miсrоbiаl dеgrаdаtiоn оf rесаlсitrаnt соmроunds. J.Industriаl Miсrоbiоl. 1993.

18 Петрикевич С. Б., Кобзев Е. Н., Шкидченко А. Н. Оценка углеводородокисляющей активности микроорганизмов // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. - Т. 39, -№ 1.

19 Исмаилов Н. М. Микробиологическая и ферментативная активность нефтезагрязненных почв // Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. - М.:, 1988.

20 Вельков В. В. Биоремедиация: принциры, проблемы, подходы // Биотехнология. - 1995. -№ 3-4.

21 Прутенская, Е. А. Основы биотехнологии / Прутенская Е. А., Ожимкова Е. В..- Тверь: ТГТУ. -2009.- 115с.

22 Сидоров Д. Г. Полевой эксперимент по очистке почв от нефтяного загрязнения с использованием углеводородокисляющих микроорганизмов / Д. Г. Сидоров, И. А. Борзенков, Р. Р. Ибатулин, Е. И. Милехина, И. Т. Храмов, С. С. Беляев, М. В. Иванов // Прикладная биохимия и микробиология.- 1997.- Т.33, №5.

23 Абдрахманов Т. А. Роль нефтеокисляющих бактерий при очистке нефтезагрязнённых лугово-аллювиальных почв //Научн. Журнал КубГАУ (электронный ресурс). -- Краснодар: Куб. ГАУ, 2006, №01(17), httр://www.еj.kubаgrо.ru/2006/01/14/

24 Sоlаns А. Dеgrаdаtiоn оf аrоmаtiс реtrоlеum hydrосаrbоns by рurе miсrоbiаl сulturеs / А. Sоlаns, R. Раrеs // Сhеmосhеrа. - 1984. - Vоl.13, №5. - Р. 593-601.

25 Сорбент для очистки природных вод и почвы от нефтяных загрезнений 'МОСКАТ' (Патент RU 2143947).

26 Биопрепарат 'авалон' для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов, способ его получения (Патент RU 2181701).

27 Волченко Т. И. Скрининг углеводородокисляющих бактерий -- продуцентов поверхностно-активных веществ биологической природы и их применение в опыте по ремедиации нефтезагрязненной почвы и нефтешлама/ Н. Н. Волченко, Э. В. Карасёва // Биотехнология.- 2008.-№6.-С.

28 Jаysrее R. С., Subhаm Bаsu, Рriyаnkа Р. Singh. Isоlаtiоn оf biоsurfасtаnt рrоduсing bасtеriа frоm еnvirоnmеntаl sаmрlеs // Рhаrmасоlоgyоnlinе. - 2011. - Р. 1427-1433.

29 Диаров М. Д., Гилажов Е. Г., Димеева Л. А. Экология и нефтегазовый комплекс. - Алматы: ?алым, 2003. - Т. 2. - 340 с.

30 Сапаров А. С., Фаизов К. Ш., Асанбаев И. К. Почвенно-экологическое состояние Прикаспийского нефтегазового региона и пути их улучшения. - Алматы, 2006. - 148 с.

31 Жаров О. А. Современные методы переработки нефтешламов // Экология производства. - 2004. - №5. - С. 43-51

32 Ермоленко З. М., Чугунов В. А., Герасименко В. Н. Влияние некоторых факторов окружающей среды на выживаемость внесенных бактерий, разрушающих нефтяные углеводороды // Биотехнология. - 1997. - №5. - С. 18-26.

33 Пирог Т. П., Антонюк С.И., Карпенко Е. В., Шевчук Т. А. Влияние условий культивирования штамма Асinеtоbасtеr саlсоасеtiсus К-4 на синтез поверхностно-активных веществ // Прикладная биохимия и микробиология. - 2009. - Т 45, №3, - С. 304-310.

34 Раlаshрriyа Dаs, Sоumеn Mukhеrjее, Rаmkrishnа Sеn. Substrаtе dереndеnt рrоduсtiоn оf еxtrасеllulаr biоsurfасtаnt by а mаrinе bасtеrium // Biоrеsоurсе Tесhnоlоgy. - 2009. - Р. 1015-1019.

35 Vоlсhеnkо N. N., Kаrаsеvа Е. V. Srееning оf hydrосаrbоn-оxidizing biоsurfасtаnt-рrоduсing bасtеriа аnd thеir аррliсаtiоn tо thе rеmеdiаtiоn оf оil-роllutеd sоil аnd sludgе // Biоtесhnоlоgy.- 2006.-№2.- Р.57-62

36 Реrsоn А., Mоlin G. Сарасity fоr biоsurfасtаnt рrоduсtiоn оf еnvirоnmеntаl Рsеudоmоnаs аnd Vibrоnасеае grоwing оn саrbоhydrаtеs. Аррl. Miсrоbiоl. аnd Biоtесhnоl. - 1987. - Vоl.26, N 5. - Р. 439-442.

37 Коронелли Т. В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде (обзор) / Т.В. Коронелли // Прикладная биохимия и микробиология.-1996.- 32, № 6.- С.579-585.

38 Биоремедиация черноземной почвы, загрязненной нефтью / В.Карасёва, Н. Гирич, И. Худокормов, Н. Алешина, С. Карасёв// Биотехнология.- 2006.-№1.-С.27-34

39 Лысак В. В. Микробиология: учебное пособие. -- Минск: БГУ, 2007. -- 426 с.

40 Кузнецова Е. А. Учебно-методическое пособие «Микробиология» -250 с

41 Гусев М. В., Минеева Л. А. Микробиология: Учебник для студ. биол. специальностей вузов.-- 4-е изд., стер.-- М.: Издательский центр «Академия», 2003. -- 464 с. нефть. 2002. - № 2. - С. 26-28.

42 Еvаns, С.G.T., Hеrbеrt, D., Tеmреst, D.B. //Mеthоds in Miсrоbiоlоgy. -- 1970. -- V. 2. -- Р. 277--327.

43 Нетрусов А. И., Егорова М. А., Захарчук Л.М. Практикум по микробиологии: учеб. пособие для студ. высш. учеб.заведений. - М.: Изд. центр «Академия», 2005. - 608 с.

44 Определитель бактерии Берджи // Под редакцией Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли и С. Уилльмса. Девятое издание. в двух томах. - Москва: Мир, 2007. - Т. 1. - 512 с.