Сорбционное извлечение и ВЭЖХ-определение фенольных веществ в растительных материалах

/

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

(ФГБОУ ВПО «КубГУ»)

Кафедра аналитической химии

ДИПЛОМНАЯ РАБОТА

СОРБЦИОННОЕ ИЗВЛЕЧЕНИЕ И ВЭЖХ-ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕНОЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ В РАСТИТЕЛЬНЫХ МАТЕРИАЛАХ

Работу выполнила В. В. Милевская

Факультет химии и высоких технологий, ОФО

Специальность «Химия» - 020101

Нормоконтролер,

канд. хим. наук, доц. О.Б. Воронова

Краснодар 2012

Реферат

Дипломная работа: 69 с., 17 рис., 18 табл., 1 приложение, 50 источников литературы.

Цель работы: изучение процессов сорбционного извлечения фенольных веществ из растительных матриц для последующего хроматографического определения.

В дипломной работе приведен сравнительный анализ способов извлечения фенольных веществ, характеристика метода твердофазной экстракции, параметры хроматографического определения фенолкарбоновых кислот и флавоноидов в растительных объектах.

В ходе проведенных исследований показана возможность использования сорбента с привитой фазой С18 для очистки растительных образцов от компонентов матрицы. Выявлено, что сорбент С18 является более эффективным для извлечения фенольных веществ по сравнению с экстракцией этилацетатом и твердофазной экстракцией с применением сорбента на основе сверхсшитого полистирола. Определены условия твердофазного извлечения фенольных веществ, а именно, рН, скорость подачи растворов через патрон, минимальные объемы элюента, необходимые для десорбции целевых компонентов. Получены экспериментальные данные, которые показывают, что галловая кислота не подвергается концентрированию на октадецилсилане. Установлено, что концентрирование кофейной кислоты из водного отвара календулы аптечной также не происходит в данных условиях. В то же время, удалось достичь концентрирования рутина из водного отвара подорожника с коэффициентом 30 и (-)-эпикатехина из водного отвара зверобоя продырявленного в 12 раз.

Ключевые слова в дипломной работе: ФЕНОЛЬНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, ТВЕРДОФАЗНАЯ ЭКСТРАКЦИЯ, ВЭЖХ, РАСТИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ.

Работа выполнена на оборудовании ЦКП «Эколого-аналитический центр».

Содержание

Введение

1. Аналитический обзор

1.1 Классификация фенольных соединений

1.2 Свойства фенольных соединений и их нахождение в растительных материалах

1.3 Методы извлечения фенольных веществ

1.4 Методы экстракции фенольных соединений

1.5 Твердофазная экстракция

1.5.1 Адсорбенты для твердофазной экстракции и адсорбционной очистки

1.5.2 Адсорбционная очистка

1.5.3 Методы оценки эффективности процедуры ТФЭ

1.5.4 Факторы, влияющие на параметры сорбции

1.5.5 Твердофазная экстракция как метод разделения и концентрирования фенольных соединений

1.6 Методы определения фенольных соединений

1.7 Сочетание ТФЭ и ВЭЖХ-анализа для определения фенольных соединений

1.8 Выводы к аналитическому обзору и постановка задач исследования

2. Экспериментальная часть и обсуждение результатов

2.1 Исходные реактивы, материалы и используемая аппаратура

2.2 Приготовление рабочих растворов

2.3 Оптимизация условий пробоподготовки отвара лекарственного растительного сырья для ВЭЖХ-анализа

Заключение

Список использованных источников

Приложения

Введение

Целебные свойства трав были известны еще в древности, доказательством чего является ныне общеизвестная и распространенная во всем мире народная травяная медицина. Современным ученым известны факты использования фенольных соединений, содержащихся в растениях, в предупреждении таких опасных заболеваний, как рак и болезни сердца [1]. Препараты из лекарственных растений, содержащих комплекс биологически активных веществ, действуют на различные системы организма, в том числе и на систему антиоксидантной защиты [2]. Это одна из причин повсеместного исследования фенольных кислот и флавоноидов в последнее десятилетие на фоне стремительного увеличения уровня болезней, стрессовых ситуаций современного мира и ухудшения экологической обстановки для организма человека [3]. Также важным аспектом является возможность использования трав в производстве не только лекарств, но и питания, приправ, напитков, красящих веществ, косметики, парфюмерии [4].

Полезные свойства растений напрямую связаны с содержанием в них активных компонентов, которые могут быть определены разнообразными физико-химическими методами [5], такими как спектрофотометрические, фотоколориметрические, хроматографические и другие. Однако обращенно-фазовый вариант ВЭЖХ в настоящее время стал доминирующим методом разделения и определения фенольных веществ, особенно в сочетании с диодно-матричным УФ-детектированием.

Как правило, ключевым моментом инструментального анализа является очищение и концентрирование фенольных веществ, которое осуществляется на высокоэффективных сорбентах. Поэтому для определения низких содержаний фенольных соединений и увеличения селективности применяют предварительное сорбционное извлечение [6]. Все более перспективным направлением в этой области в последние несколько десятилетий становиться метод твердофазной экстракции.

Целью данной работы являлось изучение процессов сорбционного извлечения фенольных веществ из растительных матриц для последующего хроматографического определения.

1. Аналитический обзор

1.1 Классификация фенольных соединений

К фенольным соединениям относятся вещества, имеющие в молекуле ароматическое (бензойное) ядро, содержащее несколько гидроксильных групп. Основываясь на современных представлениях о биосинтезе, простейшими фенольными соединениями являются соединения ряда, состоящие из ароматического (фенольного) ядра и одноуглеродной боковой цепи. При усложнении биосинтетической последовательности образуются фенольные соединения ряда, состоящие из ароматического ядра и трехуглеродной боковой цепи. Более сложным путем образуются фенольные соединения?С₆ ряда (флавоноиды), состоящие из двух ароматических ядер, соединенным между собой трехуглеродным фрагментом. Все остальные фенольные соединения образуются из этих основных структур при помощи вторичных реакций [2].

Фенольные соединения подвергаются четкой классификации, в основе которой положен биогенетический принцип.

В частности к фенолкарбоновым кислотам относят галловую, протокатеховую, миндальную, 4-гидроксибензойную, ванилиновую, сиреневую, салициловую и п-анисовую кислоты. Среди них большинство относятся к фенольным соединениям ряда (таблица 1).

Таблица 1 ? Строение фенольных веществ ряда

Фенолкарбоновые миндальная и п-анисовая кислоты в данный ряд современной классификации не входят, что становится очевидным при рассмотрении их строения (таблица 2).

Таблица 2 ? Строение миндальной и п-анисовой кислот

Вторая группа исследуемых веществ состоит из фенольных соединений ряда и может быть разбита на две группы: производные коричной кислоты и кумарины. Производные коричной кислоты представлены в таблице 3.

Таблица 3 ? Производные коричной кислоты

Коричная кислота не является фенольным соединением, поскольку не имеет фенольной (гидроксильной) группы в бензольном ядре (таблица 4).

Таблица 4 - Строение коричной кислоты

Кумарины.

Объектом исследования выбран кумарин (таблица 5).

Таблица 5 - Строение кумарина

Третья группа ? фенольные соединения ряда или флавоноиды (таблица 6).

Таблица 6 - Строение флавоноидов

Гесперидин и нарингин, включенные в перечень исследуемых веществ, представляют собой соответственно рутинозид и неогесперидозид флавононов-гесперетина и нарингенина (таблица 7).

Таблица 7 - Строение гесперидина и нарингина

Рутин - 3-рутинозид кверцетина замыкает ряд соединений (таблица 8).

Таблица 8 - Строение рутина

1.2 Свойства фенольных соединений и их нахождение в растительных материалах

Фенолкарбоновые кислоты широко распространены в растениях, особенно в составе дубильных веществ. Они содержатся в растительных тканях в связанной форме и высвобождаются после гидролиза. Так, салициловая кислота обнаружена в ромашке, календуле, тысячелистнике, полыни, боярышнике, галловая кислота ? в толокнянке, зверобое, дубе, а ванилиновая кислота содержится в толокнянке. Фенолкарбоновые кислоты обладают общими свойствами гидроксикарбоновых кислот. Их растворимость в воде варьируется в зависимости от температуры, хорошо растворимы в спирте, диэтиловом эфире. Данные кислоты обладают антисептическими и кератолитическими свойства. Особенностью галловой кислоты является способность к самоконденсации с образованием депсидов (сложных эфиров) [2].

Гидроксикоричные кислоты также широко распространены в образцах растительного происхождения в свободном состоянии или в виде производных. Коричная кислота может быть идентифицирована в небольших количествах в качестве промежуточного продукта биосинтеза оксикоричных кислот. Характерными особенностями гидроксикоричных кислот является образование сложных эфиров с ациклическими кислотами и сахарами (главным образом глюкозой), а также существование в виде цис- и транс-изомеров. Все представители гидроксикоричных кислот обладают высокой биологической активностью и оказывают на организм общеукрепляющее, иммуностимулирующее, противовоспалительное и антиоксидантное действие. Кофейная кислота может быть определена в толокнянке и боярышнике [2].

Кумарин представляет собой внутримолекулярный сложный эфир (лактон) орто-гидроксикоричной кислоты, который образуется при попытке выделения кумариновой кислоты. Вещество растворимо в воде (0,3%), этаноле, диэтиловом эфире и других органических растворителях, во многих растениях присутствует в виде гликозидов. Известно, что ферментативный гидролиз «связанного» кумарина приводит к образованию свободного кумарина. Характерным для кумарина является отсутствие свободной фенольной группы, в то время как его производные относятся к типичным фенольным соединениям. Значимым качеством кумарина является способность оказывать разнообразное физиологическое воздействие на организм человека [2].

Катехины - наиболее восстановленная подгруппа флавоноидов. Они распространены в растениях в свободном состоянии и в виде производных галловой кислоты, не встречаются в форме гликозидов. Определяемый (-)-эпикатехин - стереоизомер молекулы катехина. У данного стереоизомера отмечена наибольшая Р-витаминная активность. Также известно, что он хорошо растворим в воде и полярных органических растворителях, легко окисляется кислородом воздуха, особенно при нагревании и на свету, что создавало трудности при его выделении до разработки хроматографических методов. Катехины склонны к полимеризации, а образующиеся полимеры входят в состав дубильных веществ [2].

Представителем флаванонолов является дигидрокверцетин, являющийся лабильным соединением, в связи, с чем не накапливается в растениях в значительных количествах. Чаще находится в свободном состоянии, чем в форме гликозидов, проявляет Р-витаминную активность, в 3-4 раза превосходящую таковую кверцетина [2].

Кверцетин - один из самых распространенных флавонолов. Данное вещество плохо растворимо в воде, при нагревании растворимо в этаноле, в растворах щелочей, в органических аминах. Кверцетин является активным антиоксидантом, особенно в смесях с аскорбиновой кислотой; проявляет свойства витамина Р. Этот флавонол обнаружен в растениях в форме гликозидов и идентифицирован в боярышнике, зверобое, дубе, ромашке, тысячелистнике.

Одним из самых распространенных в растениях гликозидов кверцетина является рутин. Он обладает капилляроукрепляющими свойствами, Р-витаминной активностью и определен в боярышнике, зверобое, ромашке, пустырнике [2].

Большинство флаванонов растворимы в этаноле, горячей воде, растворах щелочей. При дегидрировании флаванонов в положении гетероцикла образуются флавоны, поэтому флавоны сопровождают соответствующие флаваноны. Последние часто встречаются в виде 7-рамногликозидов, причем сахарные остатки могут быть представлены либо рутинозой, либо неогесперидозой. Таковыми являются исследуемые гесперидин и нарингин [2].

Ценными являются антиоксидантные свойства фенольных соединений, обусловленные наличием гидроксильных групп [5]. Установлено, что дубильные вещества взаимодействуют с перекисными радикалами липидов и благодаря этому являются эффективными ингибиторами их перекисного окисления. Также доказано, что фенольные вещества уменьшают образование супероксид-аниона в системе ксантин-ксантин оксидаза [2].

Нахождение фенольных соединений в растительном сырье. В зависимости от вида и рода растения процессы метаболизма и накопления фенольных веществ проходят разными путями, что определяет фенольный состав тех или иных представителей флоры. Так в листьях толокнянки были обнаружены гидрохинон, арбутин, галловая, эллаговая, ванилиновая, кофейная, n-оксибензойная кислоты, флавоноиды.

В траве зверобоя и тысячелистника содержатся те же дубильные вещества и свободные органические кислоты, что и толокнянке, а также керотин, аскорбиновая кислота, гиперицин, витамины К и С. В свою очередь, кора дуба содержит дубильные вещества, образованные в результате окислительной конденсации катехинов, галловую и эллаговую кислоты, а также кверцетин, гесперидин, рутин. В цветках календулы обнаружены каротиноиды, дубильные вещества, флавоноиды, органические кислоты, аскорбиновая кислота и другие БАВ [2].

1.3 Методы извлечения фенольных веществ

Основной стадией пробоподготовки фенольных соединений является выделение из растительной матрицы для последующего анализа в сиситеме ВЭЖХ. Существуют разноообразные способы извлечения и экстракции фенольных компонентов, среди которых извлечение растворителем, Сокслет-экстракция, жидкость-жидкостная экстракция, твердофазная экстракция и другие.

Извлечение растворителем. Полярные антиоксиданты, также как и фенольные кислоты и гликозиды флавоноидов, экстрагируются водой или спиртом или смесью данных растворителей [7]. В большинстве случаев в качестве растворителей в данном способе используются метанол и ацетонитрил [8]. Jessica de Matos Nunes и др. использовали метанольный вариант экстракции в процессе подготовки растительного образца для определения хлорогеновой кислоты и флавоноидов в 13 видах зверобоя, произрастающих в южной Бразилии [7].

Что касается водной экстракции, то в ряде случаев она может оказаться более эффективной по сравнению с экстракцией органическими растворителями. В работе G. S. Cetkovic и др. для оценки антиоксидантных свойств календулы спектрофотометрическими методами сравнили суммарное содержание фенольных веществ в метанольном и водном экстрактах. Оказалось, что большее количество соединений данного класса в последнем варианте [9].

Сокслет-экстракция. Также известна так называемая Сокслет-экстракция, которая не часто используется для извлечения фенольных соединений. Однако в литературе встречаются примеры применения данного вида экстракции, среди которых работа G. Sagratini и др. [10]. Исследователи провели анализ хлорогеновой кислоты и флавоноидов восьми видов зверобоя. Экстракция целевых компонентов осуществлялась в аппарате Сокслета, используя смесь метанола и ацетона в течение 4 часов. Процентный выход в данном случае составил от 19.2% до 34.6%.

1.4 Методы экстракции фенольных веществ

Разнообразие фенольных соединений и их присутствие в растительных материалах наряду с продуктами общего обмена и вторичными метаболитами является основанием для предварительного фракционирования [2].

Наиболее распространенным методом экстракции является метод ЖЖЭ, который до недавнего времени был единственно возможным, когда речь шла об экстракции фенольных соединений. В последнее время развивается новое направление - ТФЭ -, реализуемая на основе полимеров с молекулярными отпечатками, сорбентов из модифицированных силикагелей и сверхсшитого полистирола, которая эффективна как на стадии экстракции, так и на стадии очистки, что также можно использовать для извлечения фенольных веществ из растительных материалов для последующего определения в системе ВЭЖХ-УФ.

Жидкость-жидкостная экстракция. В случае жидкость-жидкостной экстракции (ЖЖЭ) разделение основано на распределении компонентов между двумя несмешивающимися жидкостями, для чего обычно применяют этилацетат и диэтиловый эфир, возможно добавление небольшого количества кислоты.

Особенно примечательны результаты работ, в которых авторы проводят сравнение методов ТФЭ и ЖЖЭ. Так, G. Zgorka и S. Kawka [11] определяли фенольные кислоты в метанольных экстрактах элеутерококка (корни растения и фармпрепараты). Одновременно были использованы методы жидкость-жидкостной и ТФ экстракции. Как показали результаты исследования, метод ТФЭ является эффективным, особенно при определении хлорогеновой, феруловой, кофейной кислот, и имеет в ряде случаев большие значения степеней извлечения в сравнении с методом ЖЖЭ. Так, например, для хлорогеновой и феруловой кислот относительные степени извлечения (ЖЖЭ/ТФЭ) составляют 2.9 и 2.4 % соответственно.

Другие исследователи, B. Suаrez, A. Picinelli и J. Mangas [12], провели фракционирование фенольных соединений на патронах C18 (Extra-Sep, Sep-Pakclassic, Sep-Cartridge, метанол) из яблочного сусла и сидра. Приведены сравнительные результаты ТФЭ и ЖЖЭ, которые показали, что в случае ТФЭ степени извлечения составили от 111 до 84%, в то время как результаты ЖЖЭ в пределах от 82 до 64% и всего для четырех соединений, а остальные не были обнаружены. На основе полученных данных был сделан вывод о том, метод ТФЭ является достаточно простым и легким и более эффективным для суммарного определения основных представителей фенольных соединений.

Также стоит отметить в качестве недостатка ЖЖЭ по сравнению с методом ТФЭ больший расход растворителя и временные затраты [8].

Полимеры с молекулярными отпечатками. Относительно новой разновидностью ТФЭ является метод с применением полимеров с молекулярными отпечатками (ПМО). Его отличительная особенность - высокая селективность сорбента по отношению к определяемому аналиту, а также высокая механическая и термическая устойчивость.

Так В. Кудринская, С. Дмитриенко и др. синтезировали полимеры с молекулярными отпечатками кверцетина и соответствующие полимеры сравнения с использованием акриламида и 2-(диметиламино)-метилметакрилата в качестве функциональных мономеров. На примере структурно родственных соединений проведена оценка селективности сорбента. Показано, что полимер на основе акриламида способен к селективной сорбции кверцетина, причем центры связывания кверцетина имеют преимущественно гидрофобный характер [13].

Однако основным недостатком ПМО является то, что полимер должен быть синтезирован для каждого конкретного случая, а также невозможность применения его для других аналитов. Это противоречит основному принципу определения широкого круга веществ в объекте одновременно [8].

1.5 Твердофазная экстракция

Особого рассмотрения требует метод твердофазной экстракции, широко используемый в последние десятилетия и применимый для сорбционного выделения и концентрирования полярных органических соединений, среди которых фенолы и фенолкарбоновые кислоты.

Наиболее распространенным вариантом ТФЭ является метод динамического офф-лайн концентрирования, при котором стадии пробоподготовки и идентификации аппаратно разделены. В этом методе анализируемый раствор пропускается через картридж, заполненный адсорбентом. При правильном подборе условий сорбции целевые компоненты пробы могут быть практически полностью извлечены из раствора в динамическом процессе [14].

В методе ТФЭ жидкость нагнетается в картридж различными способами, среди которых использование насоса (например, перистальтического) и вручную. На первой стадии целевые соединения поглощаются адсорбентом. Такая ситуация обеспечивает значительную гибкость адсорбционного метода подготовки пробы.

Так, адсорбент с целевыми соединениями может быть промыт подходящими растворителями для удаления ряда сопутствующих компонентов. При этом целевые соединения не должны «теряться», то есть элюироваться, или разрушаться в используемых средах [15]. Впоследствии десорбция сконцентрированных в офф-лайн методе аналитов осуществляется обработкой сорбента подходящим растворителем [14].

Использование офф-лайн концентрирования позволяет существенно сократить продолжительность и ресурсозатратность пробоподготовки.

1.5.1 Адсорбенты для твердофазной экстракции и адсорбционной очистки

Характеристика сорбента С18. В настоящее время особенно распространены случаи использования привито-фазных сорбентов, особенно с привитой фазой С18. Можно выделить следующие основные преимущества использования привитых сорбентов на основе силикагеля:

1 механическая устойчивость;

2 риск перехода привитой фазы в растворитель максимально снижен (если не протекают реакции, приводящие к химическому отщеплению привитой фазы);

3 устойчивость к воздействию растворителей, температуры, воды, рН;

4 быстрота установления равновесия при смене элюента, что обеспечивает возможность работы в градиентном режиме [16].

Основной недостаток силикагеля - малая химическая стойкость при рН<2 и рН>9 (кремнезем растворяется в щелочах и кислотах).

Наличие органического радикала -(CH₂)₁₇CH₃ на поверхности химически модифицированного силикагеля делает возможным его применение для разделения широкого круга органических веществ различной природы. Отличительной особенностью сорбента С18 является его высокая селективность по отношению к гомологам [17].

Характеристика сорбента ССПС. Сорбенты на основе сверхсшитого полистирола отличают высокоразвитая удельная поверхность, относительно маленький размер пор и выраженное сродство к полярным органическим соединениям. Также они устойчивы к физическим и химическим воздействиям и легко регенерируются [17].

Особенным свойством сверхсшитых полистиролов является их способность концентрировать аналиты не только из водных сред, но и из органических растворителей. Из метанола и ацетонитрила активно сорбируются неполярные аналиты [14]. Эффективность применения сорбента на основе сверхсшитого полистирола для одновременной экстракции фенольных кислот и флавоноидов подтверждена исследованиями B. S. Inbaraj и др. [18].

1.5.2 Адсорбционная очистка

Процесс пробоподготовки зачастую включает этап снижения содержания компонентов матрицы в пробе, которые могут помешать определению анализируемых веществ или стать источником загрязнения аппаратных узлов.

Стоит заметить, что в большинстве научных публикаций метод ТФЭ используется только на стадии очистки, а концентрирование либо не достигнуто, либо выполняется на последующих стадиях пробоподготовки, таких как выпаривание или сушка в токе азота, в процессе которых происходят дополнительные потери аналитов [6].

B. Inbaraj и др. предложили использовать картриджи Phenomenex Strata-X на полимерной основе именно на стадии очистки экстракта Lycium barbarum (в России- чапыжник, чилига, дереза обыкновенная) и определяли 53 представителя фенольного ряда. В качестве растворителя применяли метанол, определение веществ проводили в системе ВЭЖХ-УФ-ЭСИ-МС. Эффективность стадий экстракции и очистки была подтверждена значениями степеней извлечения кофейной, хлорогеновой, р-кумаровой кислот, рутина и каемфирола-3-O-рутинозида с использованием стандартных растворов этих веществ на уровне 90% для стадии экстракции этанолом и последующей очистки на полимерном картридже [18].

Так X. Lai и др. провели определение четырех фенольных веществ в биологических жидкостях методом ВЭЖХ с предварительной твердофазной экстракцией (Winchem TM C18-SPE картридж, China). Выяснилось, что твердофазная экстракция позволяет получить более чистый экстракт и устраняет большинство проблем при переводе его в состояние эмульсии, с которыми приходится сталкиваться при использовании жидкость-жидкостной экстракции, и твердофазное концентрирование в сочетании с ВЭЖХ является простым и надежным методом. Значения степеней извлечения составили от 75.8 до 111.4 % [19].

С другой стороны, R. Govindarajan, D. Singh, A. Rawat использовали SAMPREP RP18 картриджи также на стадии очистки экстракта «ЧАВАНПРАШ» (уникального натурального продукта, изготовленного из 50 лекарственных трав и природных минералов по старинному рецепту), содержащего ряд веществ фенольной группы (кофейная кислота, кверцетин, галловая кислота, рутин и др.), в качестве растворителя использовали метанол. Анализ проводили в системе ВЭЖХ с диодной матрицей. Значения степеней извлечения составили от 89.79 до 97.86% [20].

1.5.3 Методы оценки эффективности процедуры ТФЭ

Важным понятием, применяемым для оценки эффективности стадии адсорбции на концентрирующих картриджах, является понятие «проскока». График зависимости концентрации исследуемого вещества в фильтрате от объема, пропускаемого через картридж жидкого образца, называется «кривой проскока». Обычно она имеет S-образную форму с достаточно резким подъемом концентрации аналита в области насыщения им картриджа. Объемом «до проскока» принято считать тот объем пропускаемого образца, при котором концентрация аналита в фильтрате достигает 5% от его концентрации в исходном растворе. Значения объемов «проскока» справедливы лишь для тех условий, в которых они определены [14].

На практике, когда через картридж пропускается реальный жидкий образец или первоначальный экстракт со сложной матрицей, наблюдаемые значения объемов пробоя могут оказаться значительно ниже «идеальных», что обусловлено конкуренцией доминирующих компонентов матрицы с адсорбцией аналитов. Другими словами, при повышенных концентрациях сорбируемых соединений насыщение сорбента в картридже наступает раньше, и объем проскока соответственно уменьшается [14].

Эффективность ТФЭ также включает в себя эффективность сорбции интересующего компонента из раствора матрицы и эффективность последующей десорбции данного компонента. Суммарная эффективность экстракции, или степень извлечения (R) i-го компонента пробы по ходу всех проделанных операций, может быть рассчитана по формуле: R = q_i /Q_i , где q_i - количество i-го компонента, извлеченного из матрицы; Q_i - количество i-го компонента в матрице. Эта величина должна быть учтена в первую очередь при проведении количественного определения интересующих компонентов. Для повышения степени очистки и понижения предела обнаружения концентрируемых соединений необходимо стремиться к максимальной эффективности ТФЭ, в связи с чем особое значения приобретают методические аспекты процедуры пробоподготовки [21].

1.5.4 Факторы, влияющие на параметры сорбции

На основе литературного обзора стало ясным, что традиционный подход к подбору оптимальных условий, основанный на варьировании параметров экстракционного процесса, таких как растворитель, рН, время и др., не привел до сих пор к их универсальному сочетанию, и исследования в этом направлении могут быть продолжены. В большинстве случаев применение патронов на этапе пробоподготовки сопровождается понижением рН раствора до 2.00, но авторы не дают обоснования этому, а в редких случаях находят лишь теоретическое объяснение данному действию. Имеются данные об изучении зависимости степени извлечения фенольных веществ от рН в работе Qian Liu и др. [6], которые провели определение семи фенольных веществ в речной воде с помощью ВЭЖХ с предварительным концентрированием на сорбенте XAD-4 (стирол-дивинилбензол). Установили, что наибольшая степень извлечения кофейной кислоты, рутина, кверцетина и др. веществ достигается только в пределах рН от 2.5 до 4.0, после чего значение этого показателя падает. Исследования проводились в статическом режиме. Таким образом, вопрос о влиянии уровня рН раствора на параметры сорбции, в частности десорбцию компонентов и их степени извлечения, в динамическом режиме остается открытым и требует дальнейшего изучения.

1.5.5 Твердофазная экстракция как метод разделения и концентрирования фенольных соединений

Методы анализа фенольных веществ можно классифицировать по двум признакам: определение суммарного содержания фенолов и количественное определение индивидуальных компонентов или групп фенольных соединений, обладающими общими специфическими свойствами. Но независимо от метода анализа, вещества фенольной природы должны быть экстрагированы из их первоначального источника [22]. Процесс экстракции из растительных материалов в этом случае зависит от многих факторов, среди которых метод экстракции, природа фенольного соединения, гранулометрический состав, мешающее влияние и др. Однако экстракты обычно представляют собой смесь различных классов фенольных соединений. Поэтому необходимым является этап отделения нежелательных фенольных компонентов и веществ нефенольной природы (парафины, жиры, хлорофилл). Для этих целей повсеместно используется фракционное разделение с использованием твердофазной экстракции [22].

Основная цель работы Michalkiewicz и др. [23] заключалась в детальном исследовании процесса твердофазной экстракции фенольных кислот (галловой кислоты, p-кумаровой кислоты, кофейной кислоты и др.) и некоторых флавонолов (рутина, кверцетина и др.), содержащихся в меде. Установлено, что сорбент на основе С18 (Bond Elut) менее всего подходит для выделения и концентрирования данных веществ. Однако, некоторые полифенольные соединения, например кверцетин и рутин, имеют в этом случае достаточно высокую степень извлечения. Сорбенты на основе полимерных структур дивинилбензола и N-винилпирролидон (Oasis HLB), а также полистирола-дивинилбензола (Strata-X) показали лучшую способность при извлечении фенольных веществ, что объясняется их ароматической структурой, которая может сорбировать ароматические фенольные кислоты путем р-р взаимодействия. Так, степень извлечения галловой кислоты (более 60%) и 4-гидроксибензойной кислоты (более 80%) была достигнута только с применением полимерной структуры дивинилбензола и N-винилпирролидона.

Boguslaw Buszewski и др. [24] изучили процесс одновременного выделения рутина и эскулина из растительных материалов и препаратов, используя твердофазную экстракцию. Исследователями был выбран подход, при котором варьированию подвергали свойства неподвижной фазы. Для изучения были выбраны твердофазные колонки с различными химически связанными фазами, содержащими полярные и неполярные функциональные группы. В ходе исследования были получены изотермы сорбции, анализ которых показал, что для рутина наибольшая сорбционная способность достигается на неполярных сорбентах, преимущественно на С18, а для эскулина это же наблюдается на сорбентах, содержащих фенольные группы. Для обоих веществ высокая сорбционная способность отмечалась при использовании полярных сорбентов, содержащих NH₂, CN и диольную группы. Также были получены данные процентного извлечения рутина и эскулина с использованием сорбентов различной полярности и установлено, что для обоих соединений высока степень извлечения на всех типах сорбентов (более 90%), только для Ph-сорбентов она чуть ниже и составляет 88.1-89.3 %.

О. Медведева и др. предложили методику динамического сорбционного концентрирования фенолкарбоновых кислот с последующим их определением методом капиллярного зонного электрофореза с предварительным их концентрированием на микроколонке, заполненной ССПС MN-200. Установлено, что степень извлечения кофейной и галловой кислот составляет 60% и 70% соответственно, а также что количественное извлечение фенолкарбоновых кислот, сорбирующихся на ССПС, может быть достигнуто из водных растворов, не превышающих 30 мл, что следует из выходной динамической кривой. Максимальным сродством к поверхности ССПС обладают наиболее гидрофобные коричная и салициловая кислоты [25].

Из приведенных данных видно, что эффективность метода сорбционного извлечения подтверждается многочисленными экспериментальными исследованиями, что позволяет использовать его в процессе пробоподготовки растительных материалов для последующего анализа.

1.6 Методы определения фенольных соединений

Идентификация фенольных соединений. Идентификация данных веществ основана на хроматографических методах (хроматография на бумаге и тонкослойная), спектральных исследованиях, качественных реакциях и масс-спектрометрическом изучении продуктов расщепления. Но для идентификации фенольных соединений в большинстве случаев пользуются спектрами их поглощения в ультрафиолетовой области (220-400 нм). Все фенолы имеют выраженную хромофорную систему, поэтому их спектры информативны и обеспечивают существенную информацию о структуре, дающую возможность определить тип фенола [26]. Например, флавоны и флавонолы обладают примерно равной интенсивностью поглощения в области около 250-350 нм. Наличие заместителей определяет положение УФ-спектра фенольных соединений также, как и наличие кольца В или А [2]. УФ-спектр флавоноидов характеризуется, как правило, двумя максимумами поглощения. Так флавоны и флавонолы обычно имеют сильную полосу поглощения при 320-380 нм (полоса I) и при 240-270 нм (полоса II). Положение и интенсивность максимумов зависят от дальнейших структурных различий. В флаванонах цикл В не сопряжен с карбонильной группой, поэтому они обнаруживают наиболее сильное поглощение в области 270-290 нм (полоса II), тогда как полоса I образует уступ некоторой интенсивности при 320-330 нм. Спектры кумаринов содержат две главных полосы при 278 и 310 нм, а у их гидроксильных производных главный максимум расположен выше 300 нм [27].

ИК-спектроскопия, позволяющая обнаружить ряд характерных группировок, меньше распространена в исследовании фенольных соединений, но может быть применена для изучения строения флавоноидных гликозидов [2].

Полуколичественные методы определения фенольных соединений. Известен ряд методов полуколичественного суммарного определения фенольных соединений. Чаще применяются следующие:

1 спектрофотометрический метод с использованием реактива Фолина-Дениса;

2 весовой метод с применением кожного (гольевого) порошка;

3 титриметрический метод Левенталя.

Включают также потенциометрическое титрование в неводных растворителях (диметилформамид) с применением катоднополяризованного платинового электрода и метод комплексонометрического титрования свинца в осаждаемых соединениях раствором трилона Б в среде ацетатного буфера в присутствии металлиндикатора ксиленолового оранжевого [28].

Флавоноиды способны восстанавливаться на ртутно-капельном катоде, что использовано для полярографического определения их в растительном сырье. Однако потенциалы полуволн различных флавоноидов мало отличаются, в связи с чем этим способом определяют только общее содержание флавоноидов. Чувствительность определения по сравнению с фотоколориметрическими методами недостаточна (2-4 мг в 10 мл раствора). Также имеются указания на отсутствие достаточной воспроизводимости полярографического метода из-за образования различных таутомерных форм флавоноидов [28].

Спектрофотометрические методы. Флавоноиды обладают интенсивностью поглощения в УФ области спектра с наличием максимумов, относящихся к первой (320-380нм) и второй полосе поглощения (240-270 нм). Эти спектральные свойства использованы для разработки спектрофотометрических методов определения флавоноидов. Так, Данилова и Попов осуществили количественное определение дубильных веществ в корнях щавеля конского методом спектрофотометрии в сравнении с методом перманганатометрии и доказали большую точность первого [29]. Однако ввиду близости положения абсорбционных максимумов различных флавоноидов для анализа их смесей, а также при наличии других веществ необходимо предварительное хроматографическое разделение на бумаге или полиамиде [28].

Фотоколориметрические методы. Различают колориметрические методы, основанные на реакциях комплексообразования, восстановления в кислой среде, диазосочетания и др. [28]. Так, Земцова и Дмитриев [30] использовали спектрофотометрическую методику, основанную на измерении оптического поглощения этанольного раствора флавоноидов в максимуме поглощения рутина при длине волны 362,5 нм с использованием в качестве стандартного раствора рутина. Эта же методика была применена для фотоколориметрического определения с использованием светофильтра с максимумом пропускания 364±5. Авторы применили фотоколориметрическое определение с использованием антоцианидиновой реакции. Методика основана на восстановлении флавоноидов магнием в присутствии HCl в спиртовом растворе и последующем фотометрировании полученного раствора. Применение антоцианидиновой реакции несколько повышает точность метода, но при этом увеличиваются ошибка метода и время определения. Важнейшим аспектом является то, что данные методы дают завышенные результаты по сравнению с хроматоспектрофотометрией, вследствие мешающего поглощения сопутствующих экстрактивных веществ.

Методы, основанные на реакциях комплексообразования. Флавоноиды, являясь полифенольными соединениями, способны образовывать с различными катионами металлов, а также с борной кислотой растворимые окрашенные комплексы. Это свойство обусловлено наличием следующих комплексообразующих группировок:

Прочность комплексов зависит от значения pH растворов, растворителя, соотношения компонентов и природа металла. Для определения флавоноидов используются комплексы флавоноидов с хлористым цирконием, хлористой сурьмой, солями титана, ионами хрома, молибдатом аммония, комплексы флавоноидов с борной кислотой и с ионами других металлов [28]. Так, флавоноиды реагируют с хлоридом алюминия с образованием желтого окрашивания или желто-зеленой флюоресценции. Интенсивность окрашивания измеряют спектрофотометрически при 340-420 нм. Известно, что реакция с хлоридом алюминия применялась для определения рутина в растительном сырье. Однако, ввиду близости абсорбционных максимумов комплексов флавоноидов с ионом алюминия реакция недостаточно специфична. Поэтому метод применяется только после бумажно-хроматографического разделения флавоноидов. Реакция непригодна для определения изофлавонов и флаванонов [28].

Капиллярный электрофорез. Капилярный зонный электрофорез в связи с его простотой, экспресностью и эффективностью широко используется наряду с высокоэффективной жидкостной хроматографией [25]. Например, Фернандес де Симон, Эстела и Хернандес провели определение стандартных флавонолов методом высокоэффективного капиллярного электрофореза. Ими были отмечены высокая чувствительность и воспроизводимость, быстрота проведения анализа, экономичность [31]. А также Кристо, Ганзлер и др. провели анализ с помощью капиллярного электрофореза и определили с хорошей точностью содержание флавоноидов в лекарственных растениях [32].

Хроматографические методы. Для анализа фенольных соединений применяется хроматография на бумаге, а также тонкослойная хроматография, имеющая ряд преимуществ, в числе которых высокая скорость процесса разделения и компактность пятен на бумаге. В качестве сорбентов в тонкослойной хроматографии используются силикагель, полиамид и целлюлоза. Для разделения флавоноидных гликозидов на силикагеле с добавкой гипса пригодны полярные смеси растворителей. При тонкослойной хроматографии на полиамиде, используя смесь метанол - ледяная уксусная кислота - вода, становится возможным разделить гликозиды флавонов, флавонолов, флавононов и изофлавонов. Так, А.А.Маркарян и А.А. Абрамов провели анализ сухого экстракта «Нефрофит» методом тонкослойной хроматографии и обнаружили в составе кверцетин, кофейную кислоту, гесперидин, рутин и другие фенольные соединения [2]. Dragant Velikovic и другие исследовали методом тонкослойной хроматографии растения, применяемые в традиционной медицине - Salvia officinalis L. и Salvia glutinosa L., и определили наличие в них флавоноидов [33].

Ионообменная хроматография не имеет широкого применения в изучении фенольных соединений, что связано с их необратимой адсорбирбцией и окислением на анионообменниках. Распределительная хроматография нашла применение при разделении на составляющие компоненты сложных природных комплексов фенольных соединений. Например, Брэдфилдом успешно был осуществлен процесс разделения катехинов цейлонского чая [2]. Распространен метод противоточного распределения, а также в биохимии - метод гель-фильтрации [2]. Перспективной является также адсорбционная хроматография. Появление многочисленных сорбентов определило возможность успешного разделения большинства фенольных соединений.

Высокоэффективная жидкостная хроматография. Потребности химических и естественных наук в 60-80 годах XX века определили появление кардинально нового направления - высокоэффективной жидкостной хроматографии. Важнейшее свойство ВЭЖХ по сравнению с газовой хроматографией - возможность исследования практически любых объектов без каких-либо ограничений по их физико-химическим свойствам, например, по температурам кипения или молекулярной массе. Изучение существующих способов разделения, определения и анализа фенольных соединений позволило сделать обоснованный вывод о том, что ВЭЖХ - современный метод их определения, позволяющий добиться наилучших результатов [16]. Например, W. Zheng и др. [4] определили содержание фенольных соединений в 27 кулинарных и 12 лекарственных травах методом ВЭЖХ с УФ детектированием. В качестве подвижной фазы использовалась градиентная система ацетонитрил - муравьиная кислота. Детектирование проводилось при 280, 330, 350 нм. Среди определенных соединений - кофейная, ванилиновая кислоты, нарингин, кверцетин.

Для детального изучения компонентного состава фенольных соединений травы шалфея мутовчатого В. Н. Бубенчикова и др. [34] применяли метод ВЭЖХ. Рабочая длина волны 254 нм. Идентификацию разделенных веществ проводили путем сопоставления времен удерживания пиков, полученных на хроматограмме пробы со временами удерживания стандартных растворов (РСО). В результате в траве шалфея мутовчатого обнаружено 27 веществ фенольной природы, из них впервые - умбеллиферон, галловая кислота, хлорогеновая кислота, эпикатехин, кофейная кислота, цикоревая кислота, феруловая кислота, розмариновая кислота, кверцетин, лютеолин, скополетин, кемферол.

Согласно литературному обзору, из известных методов анализа фенольных соединений наиболее часто применяемый, надежный метод ? обращено-фазовая ВЭЖХ с градиентным элюированием с уменьшением полярности. Подвижная фаза обычно содержит водный компонент и менее полярный органический растворитель (ацетонитрил, метанол). Идентификация в ВЭЖХ-анализе обычно базируется на соответствии времени удерживания исследуемого фенольного соединения и подходящего стандарта Чаще всего детектирование в ВЭЖХ основывается на измерении УФ спектра и спектра в видимой области [26]. Из приведенных данных видно, что методы, применяемые для определения фенольных веществ разнообразны, информативны. Но на наш взгляд ВЭЖХ с диодно-матричным детектированием повышает эффективность за счет предварительного разделения и последующего детектирования одновременно. Это позволяет с достаточной надежностью идентифицировать и количественно определять все фенольные вещества в смеси.

1.7 Сочетание ТФЭ и ВЭЖХ-анализа для определения фенольных соединений

фенольный твердофазный экстракция растительный

Использование эффективной процедуры твердофазной экстракции в сочетании с УФ-детектированием делает метод ТФЭ-ВЭЖХ чувствительным, воспроизводимым. ТФЭ-ВЭЖХ превосходит по своим характеристикам традиционные методики, используемые для определения фенольных соединений в растительных материалах и фармацевтических препаратах, что подтверждается многократными исследованиями [11]. В таблице 9 приведены некоторые примеры использования сочетания ТФЭ и ВЭЖХ для анализа фенольных веществ.

Таблица № 9 -Примеры ТФЭ-ВЭЖХ процедуры определения фенольных соединений

1.8 Выводы к аналитическому обзору и постановка задач исследования

Растительные материалы в своем составе содержат биологически активные вещества различных типов, в частности фенольной и полифенольной природы, которые обладают уникальными свойствами, обеспечивающими широкое применение лекарственных растений в фармакологии. Анализ литературных данных показал, что исследование растительных антиоксидантов не имеет на сегодняшний день достаточной и однозначно определенной базы данных и может быть подвергнуто дальнейшему изучению. Поэтому одной из задач работы является установление фенольного состава лекарственных образцов различного происхождения.

Также на основе литературного обзора становиться ясным, ВЭЖХ-анализ не заменим при определении малых количеств веществ в образцах с комплексной матрицей, таких как неочищенные растительные экстракты и другие образцы природного происхождения. Очевиден тот факт, что обращено-фазовый вариант ВЭЖХ признан эффективным способом разделения веществ фенольной природы. При этом, УФ-детектирование является оптимальным, так как диодная матрица в качестве детектора обеспечивает высокое разрешение и повышает надежность идентификации за счет возможности одновременного получения хроматографических параметров и спектральных характеристик компонентов. На основе данного вывода можно утверждать, что в задачи исследования также входят количественное определение и идентификация фенольных компонентов в составе растительных материалов.

Очищение и концентрирование фенольных веществ является ключевым моментом инструментального анализа и осуществляется на высокоэффективных сорбентах. В то же время, это связано с рядом сложностей в виду того, что экстракция фенольных веществ из растительных материалов зависит от большого числа факторов, среди которых, природа веществ, размер молекул, условия и время процессов сорбции-десорбции, а также матричный состав образца. Поэтому для определения их низких содержаний и увеличения селективности на стадии пробоподготовки применяют предварительное сорбционное извлечение, в частности метод твердофазной экстракции. Успешное использование ТФЭ связано с появлением коммерчески доступных полимерных адсорбционных материалов нового типа, сочетающих высокую емкость, механическую прочность, химическую стабильность.

Важным преимуществом ТФЭ является снижение содержания компонентов матрицы в пробе, что особенно актуально для растительных материалов, в составе которых, наряду с фенольными соединениями, присутствуют смолы, воски, каротиноиды, хлорофилл, липиды, терпены, алколоиды, сапонины и другие вторичные метаболиты.

Задачей данной работы является оптимизация условий твердофазного извлечения фенольных веществ из объектов растительного происхождения.

2. Экспериментальная часть и обсуждение результатов

2.1 Исходные реактивы, материалы и используемая аппаратура

Для выполнения экспериментальных исследований использовались следующие средства измерений, устройства, реактивы, материалы:

Хроматограф Shimadzu LC 20 Prominence c диодной матрицей;

Колонка Zorbax SB C18, 1502,1 мм, 5 мкм (Agilent);

Перистальтический насос ЛАБ-НП-1-20М по ТУ-4211-001-44330709-2000;

Концентрирующие патроны ДИАПАК С18, ДИАПАК П;

Весы аналитические «Adventurer» по ГОСТ 16474-74;

Баня водяная;

Электроплитка бытовая «Искорка,Вятка» по ГОСТ 14919-83;

Колбы мерные вместимостью 50, 100, 250, 500 см³ по ГОСТ 1770-74;

Стаканы химические вместимостью 50 см3 по ГОСТ 1770-74;

Воронки конические стеклянные;

Цилиндры мерные с носиком вместимостью 10,25 см3по ГОСТ 1770-74;

Стаканчики для взвешивания (бюксы) по ГОСТ 25336--82;

Фильтр Millipore, 0,22 мкм;

Фильтр Corning SFCA 0.45 мкм;

Одноканальные механические дозаторы «Biohitproline» с варьируемым объемом дозирования 5-50 мкл, 20-200 мкл, 100-1000 мкл, 1-5 мл;

Вата медицинская по ГОСТ 5556-75;

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72;

Азот, осч.

Ацетонитрил, сорт 0, « Криохром»

Дигидрофосфат калия по ГОСТ 4198-75;

Ортофосфорная кислота по ГОСТ 6552-80;

Галловая кислота («Сигмабиосинтез») 99%;

Кофейная кислота («Сигмабиосинтез») 99%;

Кверцетин («Сигмабиосинтез») 99%;

Рутин («Сигмабиосинтез») 99%;

Зверобой продырявленный, тысячелистник обыкновенный, календула аптечная, кора дуба («Фитофарм», Анапа).

Условия проведения анализа были подобраны ранее [44]:

С помощью программного обеспечения LC Shimadzu для хроматографа устанавливают параметры инструмента для градиентного элюирования: подвижная фаза А - ацетонитрил, подвижная фаза В - фосфатный буфер; система элюирования имеет следующий вид:

1 ступень - 3 минуты ацетонитрил 3%;

2 ступень - 1 минута ацетонитрил 3-10%, 4 минуты 10% ацетонитрил;

3 ступень - 2 минута ацетонитрил 10-20%, 3 минуты 20% ацетонитрил;

4 ступень - 1 минута ацетонитрил 20-40%, 11 минут 40% ацетонитрил.

ВЭЖХ временная программа представлена в таблице 10.

Таблица 10 - ВЭЖХ временная программа

Устанавливают:

1 параметры получения данных: - Частота сбора данных - 6,25 Гц

2 Параметры насоса:

- режим - Low pressure gradient

- соленоидный кран насоса А - LPGE

- насос А общий - 0,25 мл/мин

- раствор В 97,0%

- предельное давление (насос А) максимум - 20 МПа;

- предельное давление (насос А) минимум - 0 МПа.

3 параметры диодной матрицы:

- лампа D2;

- ширина щели - 1,2 нм;

- начальная длина волны - 190 нм;

- конечная длина волны - 390 нм;

- температура ячейки - 30° С.

4 параметры термостата колонок:

- температура - 30° С.

5 параметры автодозатора:

- модель - SIL-20A

- держатель - Rack 1.5ml Standart

- объем: 30 мкл

- глубина погружения иглы(N) - 52 мм

- глубина погружения иглы в виалу - 52 мм

- скорость - 35 мкл/сек

- скорость ввода - 15 мкл/сек

- время промывки (Т) - 3 мин

- режим промывки (А) -« Before aspiration»

- время быстрой промывки - 8 сек

6 автопромывка:

- очистка насоса - PUMPA: LC-20AD

- промывка автодозатора - 25 мин

- время ожидания - 0 мин

- насос А общий - 1.0000 мл/мин

Обработка первичных данных и расчеты проводились в среде программы LC Solution.

2.2 Приготовление рабочих растворов

Приготовление фосфатного буфера (элюента В). Для приготовления 0,04 М раствора дигидрофосфата калия на аналитических весах взвешивают 2,7000г дигидрофосфата калия, переносят в колбу вместимостью 500 мл, растворяют в дистиллированной воде и доводят ортофосфорной кислотой до рН 2,80±0, 01. Раствор фильтруют через фильтр Millipore. Раствор перемешивают.

Приготовление стандартного раствора галловой кислоты с концентрацией 0,1 г/л. Навеску 5 мг галловой кислоты помещают в колбу объемом 50 мл, приливают ацетонитрил и доводят до метки. Затем раствор помещают в емкость для хранения кислоты.

Приготовление стандартного раствора кофейной кислоты с концентрацией 0,1 г/л. Для приготовления раствора с концентрацией 0,1 г/л навеску 10 мг кофейной кислоты помещают в колбу объемом 100 мл, приливают ацетонитрил и доводят до метки. Затем раствор помещают в емкость для хранения кислоты.

Приготовление стандартного раствора кверцетина с концентрацией 0,1 г/л. Для приготовления раствора с концентрацией 0,1г/л навеску 10 мг кверцетина помещают в колбу объемом 100 мл, приливают ацетонитрил и доводят до метки. Затем раствор помещают в емкость для хранения кислоты.

Приготовление стандартного раствора рутина с концентрацией 0,1 г/л. Для приготовления раствора с концентрацией 0,1г/л навеску 10 мг рутина помещают в колбу объемом 100 мл, приливают ацетонитрил и доводят до метки. Затем раствор помещают в емкость для хранения кислоты.

Приготовление водного раствора галловой кислоты с концентрацией 0,1 г/л. Для приготовления раствора с концентрацией 0,1 г/л навеску 20 мг галловой кислоты помещают в колбу объемом 200 мл, приливают дистиллированную воду и доводят до метки.

Приготовление водного раствора кофейной кислоты с концентрацией 0,1 г/л. Для приготовления раствора с концентрацией 0,1 г/л навеску 20 мг кофейной кислоты помещают в колбу объемом 200 мл, приливают дистиллированную воду и доводят до метки.

Приготовление водного раствора рутина с концентрацией 0,05 г/л. Для приготовления раствора с концентрацией 0,05 г/л навеску 12,5 мг кверцетина помещают в колбу объемом 250 мл, приливают дистиллированную воду и доводят до метки.

Приготовление отвара лекарственного сырья. Навеску сырья («Фитофарм», Анапа) 2,0000г помещают в коническую колбу (500 мл), заливают горячей дистиллированной водой, накрывают воронкой и ставят на кипящую водяную баню на 30 мин. После охлаждения до комнатной температуры раствор фильтруют через вату в мерную колбу на 250 мл, сырье промывают водой несколько раз, доводят водой до метки. Затем раствор перемешивают и фильтруют через мембранный фильтр Corning SFCA с диаметром 0.45 мкм.

2.3 Оптимизация условий пробоподготовки отвара лекарственного растительного сырья для ВЭЖХ-анализа

В зависимости от метода к качеству пробы предъявляют следующие требования:

1 концентрация определяемых компонентов в пробе должна быть достаточной для их надежной идентификации и количественного определения;

2 концентрации в пробе веществ, мешающих определению и приводящих к загрязнению узлов оборудования, должны быть снижены до приемлемого уровня [14].

Чтобы проба отвара лекарственного сырья соответствовала данным требованиям, решено было на стадии пробоподготовки использовать патроны, заполненные сорбентами двух типов: на основе силикагеля с привитой фазой С18 и ССПС (таблица 11).

Таблица 11 - Параметры сорбентов

Исходя из того, что чаще всего для извлечения фенольных веществ используются метанол и ацетонитрил в качестве растворителей [45,8], последний был выбран нами на стадии пробоподготовки. Это обеспечит максимальную эффективность последующего ВЭЖХ-анализа пробы.

Адсорбционная очистка с помощью твердофазной экстракции. Важным преимуществом ТФЭ является снижение содержания компонентов матрицы в пробе, что особенно актуально для растительных материалов, в составе которых, наряду с фенольными соединениями, присутствуют смолы, воски, каротиноиды, хлорофилл, липиды, терпены, алкалоиды, сапонины и другие вторичные метаболиты.

В ходе наших исследований также была показана эффективность использования патронов на стадии очистки, что иллюстрирует хроматограмма, полученная методом ГХ-МС (рисунок 1-2). Полученный водный отвар тысячелистника обыкновенного пропускали через патрон Диапак С18, десорбировали компоненты 30 мл ацетонитрила, затем элюат сушили в токе азота и растворяли сухой остаток в 1 мл ацетонитрила.

(Колонка HP-Ultra 2 25 м х 0.32 мм, 0.52 мкм; Газ-носитель - гелий; Деление потока 1:5; Скорость потока 2.13 мл/мин)

Рисунок 1 - Хроматограмма отвара тысячелистника обыкновенного

(Колонка HP-Ultra 2 25 м х 0.32 мм, 0.52 мкм; Газ-носитель - гелий; Деление потока 1:5; Скорость потока 2.13 мл/мин)

Рисунок 2 - Хроматограмма отвара тысячелистника обыкновенного после очистки на патроне С18

Видно, что после пропускания отвара через сорбент С18 большая часть сопутствующих веществ, например, сахаров, удерживается на патроне. Это позволяет улучшить хроматографический профиль.

Установление параметров сорбционного процесса. Сорбцию фенольных соединений изучали на примере галловой и кофейной кислот, как основных представителей бензойных и коричных кислот соответственно, и кверцетина - представителя флавоноидов. Параметры градуировочных зависимостей были установлены ранее [46]. Для оптимизации количественного извлечения определяемых компонентов при минимальном объеме элюента была изучена десорбция тех же 3-х веществ. Предварительно через патрон пропускали по 1 мл растворов галловой и кофейной кислот и кверцетина в ацетонитриле с концентрацией 100 мкг/мл. Вещества элюировали из патрона ацетонитрилом со скоростью 1 мл/мин. Эффективность десорбции контролировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, анализируя содержание определяемого компонента в каждой фракции десорбата. В результате были получены величины степеней извлечения каждого компонента (таблица 12). Из полученных результатов видно, что галловая и кофейная кислоты достаточно хорошо извлекаются как одним, так и на другим сорбентом. В то же время для извлечения кверцетина более приемлемым является сорбент С18.

Таблица 12 -Степени извлечения фенольных веществ

Различное поведение веществ на сорбентах, модифицированных С18, наблюдается из-за отличий во взаимодействиях между сорбирующим материалом и аналитами. Механизм их десорбции вероятно зависит от взаимодействия между остаточными силанольными группами Si-OH на поверхности силикагеля и адсорбированными компонентами. Остаточные полярные группы нейтрализуются, что снижает десорбируемость компонентов и, как следствие, приводит к уменьшению значений степеней извлечения [47].

С другой стороны, неудовлетворительная степень извлечения кверцетина с сорбента на основе ССПС по сравнению с сорбентом С18, по-видимому, связана с наличием дополнительных индукционных взаимодействий между матрицей сорбента и сорбируемым компонентом, что обусловлено подобием их химической природы.

Сравнительная характеристика способов извлечения фенольных веществ. Изучив характер поведения основных представителей фенольного ряда на данных сорбентах, перешли к сравнительному анализу способов пробоподготовки: с использованием патронов С18, ССПС и традиционной экстракции этилацетатом из водных отваров тысячелистника обыкновенного и зверобоя продырявленного.. Полученные водные отвары пропускали через соответствующие патроны, десорбировали компоненты 5 мл ацетонитрила, затем элюат сушили в токе азота и растворяли сухой остаток в 1 мл ацетонитрила. Одновременно проводили жидкость-жидкостную экстракцию этилацетатом. Результаты хроматографирования представлены на рисунках 1-8 Приложения А. Оценку эффективности методов пробоподготовки проводили для зверобоя продырявленного по трем основным компонентам: рутин, (-)-эпикатехин, протокатеховая кислота; и по шести компонентам для тысячелистника обыкновенного: кофейная кислота и пять соединений группы коффеоилхинных кислот. Количественное содержание вышеуказанных соединений определяли по внешнему стандарту - феруловой кислоте (таблица 13,14).

Таблица 13 -Содержание фенольных соединений в зверобое продырявленном

Таблица 14 -Содержание фенольных соединений в тысячелистнике обыкновенном

Из полученных данных можно сделать вывод, что применение сорбента С18 для пробоподготовки является оптимальным и может быть реализовано в рамках ВЭЖХ-анализа. Сорбент Диапак С18 был выбран в качестве объекта дальнейших исследований.

Величина рН как основной параметр сорбционного процесса. Одним из важнейших факторов, влияющих на процессы сорбции-десорбции является уровень рН среды. Нахождение фенольных веществ в молекулярной или ионной форме определяет их поведение на октодецилсилане. Таким образом, необходимым представлялось изучить влияние рН на степень извлечения фенольных компонентов. Предварительно готовились водные растворы галловой, кофейной кислот и рутина с концентрацией 25 мкг/мл, рН варьировали в пределах от 4.00 до 2.00 с шагом 0.5. Затем 1 мл раствора с заданным значением рН пропускали через патрон, заполненный сорбентом С18. Вещества элюировали из патрона ацетонитрилом со скоростью 1 мл/мин. Эффективность десорбции контролировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. На основании полученных данных были определены степени извлечения обеих кислот и рутина в зависимости от величины рН. Как видно из полученных диаграмм (рисунок 3-5), оптимальным для галловой, кофейной кислот и рутина является значение рН, равное 3. При этом значении для всех трех веществ наблюдаются максимальные степени извлечения: 99,5±6, 106±7, 103±7 % соответственно.

Рисунок 3 - Зависимость степени извлечения от рН для галловой кислоты

Рисунок 4 - Зависимость степени извлечения от рН для кофейной кислоты

Рисунок 5 - Зависимость степени извлечения от рН для рутина

Высокие значения степеней извлечения при пониженном уровне рН свидетельствует о подавлении диссоциации фенольных соединений, что повышает их сродство к неполярному сорбенту. Однако при рН<2.5 наблюдается снижение количества извлекаемого аналита, что объясняется малой химической стойкостью силикагеля при низких величинах рН.

Кривые десорбции фенольных соединений. Для оптимизации количественного извлечения определяемых компонентов при минимальном объеме элюента была изучена десорбция тех же 3-х веществ при варьировании рН растворов (рисунок 6).

а в

с

Рисунок 6 - Кривые десорбции галловой кислоты (а), кофейной кислоты (в) и рутина (с) при различных значениях рН

На основании полученных кривых десорбции установлены величины объемов ацетонитрила, необходимые для десорбции каждого компонента при оптимальном значении рН=3 (таблица 15). По результатам можно заключить, что при осуществлении метода ТФЭ необходимы малые количества элюента, что значительно снижает стоимость процесса пробоподготовки и является безусловным преимуществом по сравнению с другими методами.

Таблица 15 -Параметры кривых сорбционного извлечения при рН=3

Динамические кривые процесса твердофазной экстракции. Для оценки эффективности сорбционных процессов на патроне С18 были получены динамические кривые на модельных водных растворах галловой и кофейной кислот с концентрацией 100 мкг/мл и рутина с концентрацией 50 мкг/мл (рисунок 7-9). Получение динамических кривых для кверцетина не представлялось возможным, так как его растворимость в воде мала и чувствительность методики не достаточна для его количественного определения. Для получения динамических кривых водный раствор вещества прогоняли через патрон со скоростью 1 мл/мин. Процесс контролировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии по содержанию аналита в каждой порции элюата. Из полученных зависимостей установлены объемы «до проскока» для галловой и кофейной кислот и рутина, которые составляют 0.25 мл, 0.75 мл и 28 мл соответственно.

Рисунок 7 - Динамическая кривая сорбции галловой кислоты с концентрацией 100 мкг/мл на патроне С18 при скорости подачи раствора 1 мл/мин

Рисунок 8 - Динамическая кривая сорбции кофейной кислоты с концентрацией 100 мкг/мл на патроне С18 при скорости подачи раствора 1 мл/мин

Рисунок 9 - Динамическая кривая сорбции рутина с концентрацией 50 мкг/мл на патроне С18 при скорости подачи раствора 1 мл/мин

Однако в реальных объектах содержание галловой кислоты находится в пределах 10 мкг/мл, для кофейной кислоты в пределах 20 мкг/мл, а для рутина -25 мкг/мл, что также зависит от вида и рода лекарственного растения и может варьироваться в широком диапазоне [48]. Поэтому представлялось необходимым для галловой и кофейной кислот и рутина получить динамические кривые при более низких концентрациях (рисунок 10-12). Условия оставались неизменными на фоне уменьшения концентрации фенольного соединения.

Рисунок 10 - Динамическая кривая сорбции галловой кислоты с концентрацией 10 мкг/мл на патроне С18 при скорости подачи раствора 1 мл/мин

Рисунок 11 - Динамическая кривая сорбции кофейной кислоты с концентрацией 20 мкг/мл на патроне С18

Рисунок 12 - Динамическая кривая сорбции рутина с концентрацией 25 мкг/мл на патроне С18

Сравнительный анализ динамических кривых при различных концентрациях привел к выводу, что сорбционная форма кривой при переходе к растворам с меньшей концентрацией веществ остается неизменной.

Отличительной чертой динамической кривой кофейной кислоты является наличие двух сорбционных емкостей, что можно объяснить влиянием энергии взаимодействия в системе адсорбат-адсорбат. Дисперсионное и электростатическое притяжения между молекулами кофейной кислоты может увеличиваться с ростом заполнения монослоя, поскольку среднее расстояние между ними при этом уменьшается. Однако притяжение увеличивается до некоторого предела и при плотном заполнении монослоя сменяется отталкиванием [49].

Важной особенностью применения ТФЭ является возможность концентрирования определяемых веществ. Но на основании динамических кривых на данном этапе работы можно было утверждать, что концентрированию подвергается только рутин, т.к. его объем «до проскока» составляет 28 мл. Поэтому для определения возможности концентрирования фенольных веществ на патроне, были получены динамические кривые галловой кислоты с концентрацией 10 мкг/мл и кофейной кислоты с концентрацией 20 мкг/мл при различных скоростях подачи раствора через патрон (рисунок 13-15). Предполагалось, что варьирование данного параметра повлияет на значения объемов «до проскока», так как уменьшение скорости может увеличить время для установления равновесия в системе «сорбент - сорбат».

а в

Рисунок 13 - Динамические кривые сорбции галловой (а) и кофейной (в) кислот на патроне С18 при скорости потока 0.5 мл/мин

а в

Рисунок 14 - Динамические кривые сорбции галловой (а) и кофейной (в) кислот на патроне С18 при скорости потока 1.5 мл/мин

а в

Рисунок 15 - Динамические кривые сорбции галловой (а) и кофейной (в) кислот на патроне С18 при скорости потока 2.0 мл/мин

В результате было выявлено, что при изменении скорости сорбционный профиль галловой кислоты (10 мкг/мл) не изменяется, в то время как для кофейной кислоты (20 мкг/мл) при скорости 0,5 мл/мин, также как и при 1 мл/мин, наблюдается наличие двух сорбционных емкостей, а при скорости 1,5 мл/мин и 2 мл/мин - только одной. По-видимому, при малой скорости потока сначала преобладает мономолекулярная адсорбция, а затем образование полимолекулярных слоев за счет межмолекулярного взаимодействия с последующей десорбцией [50]. С увеличением скорости пропускания раствора этот эффект не проявляется.

На основе полученных динамических кривых галловой и кофейной кислот установлены объемы «до проскока» (таблица 16).

Таблица 16 - Параметры сорбционных процессов

Столь низкие значения объемов «до проскока» значительно затрудняют концентрирование гидрофильной галловой кислоты из водных растворов с применением сорбента С18, а концентрирование кофейной кислоты при скорости пропускания раствора 2,0 мл/мин возможно из объема не более 4,0 мл.

Концентрирование галловой кислоты на октадецилсилане. Определив основные параметры сорбционного извлечения, изучили возможность концентрирования галловой кислоты из водного отвара коры дуба. Миллилитр полученного водного отвара коры дуба, рН которого доводили раствором 2М НСl до значения 3, пропускали через патрон С18 со скоростью 1 мл/мин, десорбировали компоненты ацетонитрилом, отбирая фракции 0,5, 1-3 мл, которые анализировали в системе ВЭЖХ. Как показали исследования, концентрирование галловой кислоты из реального образца невозможно, что подтверждалось ранее параметрами динамических кривых сорбции. Наличие в молекуле галловой кислоты трех гидроксильных групп обеспечивает высокое сродство к полярному растворителю, что значительно снижает удерживание на поверхности силикагеля с привитыми фазами С18.

Концентрирование кофейной кислоты на октадецилсилане. Концентрирование кофейной кислоты из растительного материала изучали на примере календулы аптечной. 4 миллилитра полученного водного отвара календулы аптечной, рН которого доводили раствором 2М НСl до значения 3, пропускали через патрон С18 со скоростью 2 мл/мин. Десорбировали компоненты ацетонитрилом, отбирая фракции 1-4 мл с шагом 1 мл, которые анализировали в системе ВЭЖХ. В результате было установлено, что кофейная кислота не подвергается концентрированию в условиях анализа реального объекта, так как смывается исходным водным отваром при попытке концентрирования на патроне С18. Сродство кофейной кислоты к сорбенту не достаточно велико из-за двух гидроксильных групп в ароматическом кольце. Также, в отличие от стандартного раствора, при концентрировании из отвара календулы аптечной на сорбционную емкость кофейной кислоты влияют многочисленные компоненты матрицы растительного образца.

Концентрирование рутина на октадецилсилане. Возможность концентрирования рутина была подтверждена с применением отвара травы подорожника (рисунок 16).

Рисунок 16 - Хроматограмма отвара подорожника до (-) и после (-) концентрирования на патроне С18

рН отвара также доводили раствором 2М НСl от до значения 3. 28 мл полученного водного отвара пропускали через патрон С18 со скоростью 1 мл/мин, десорбировали компоненты ацетонитрилом, отбирая фракции 1-5 мл с шагом 1 мл, затем анализировали в системе ВЭЖХ. Обнаружено, что рутин можно сконцентрировать примерно в 30 раз (таблица 17). Возможность концентрирования рутина определяется его сравнительно высоким сродством к поверхности модифицированного силикагеля.

Таблица № 17 - Концентрирование рутина из отвара подорожника на патроне С18

Концентрирование (-)-эпикатехина на октадецилсилане. Одновременно был проведен анализ отвара зверобоя продырявленного (рисунок 17), в котором представлялось возможным подвергнуть концентрированию (-)-эпикатехин.

Рисунок 17 - Хроматограмма отвара зверобоя продырявленного до (-) и после (-) концентрирования на патроне С18

рН водного отвара довели раствором 2М НСl до значения 3. 25 мл полученного водного отвара пропускали через патрон С18 со скоростью 1 мл/мин, десорбировали компоненты ацетонитрилом, отбирая фракции 1-6 мл с шагом 1 мл, затем анализировали в системе ВЭЖХ. (-)-эпикатехин удалось сконцентрировать в 12 раз (таблица 18), что объясняется его принадлежностью к классу флавоноидов.

Таблица № 18 - Концентрирование (-)-эпикатехина из отвара зверобоя продырявленного на патроне С18

Заключение

1 На основании величин степеней извлечения галловой и кофейной кислот и кверцетина на сорбентах С18 и ССПС установлено, что галловая и кофейная кислоты достаточно хорошо извлекаются обоими сорбентами, в то как время для извлечения кверцетина более приемлемым является сорбент Диапак С18.

2 Проведен сравнительный анализ 2-х способов пробоподготовки растительных отваров тысячелистника обыкновенного и зверобоя продырявленного: с использованием ТФЭ и традиционной жидкость-жидкостной экстракции этилацетатом. Применение сорбента Диапак С18 для извлечения целевых компонентов является наиболее оптимальным.

3 На основании кривых десорбции определены степени извлечения обеих кислот и рутина в зависимости от величины рН. Установлено, что оптимальным для галловой, кофейной кислот и рутина является значение рН, равное 3. При этом установлены величины объемов ацетонитрила, необходимые для десорбции каждого компонента при оптимальном значении рН=3.

4 Получены динамические кривые сорбции для различных концентраций галловой и кофейной кислот и рутина, сравнительный анализ которых привел к выводу, что сорбционная форма кривой при переходе к растворам с меньшей концентрацией веществ остается неизменной.

5 Получены динамические кривые галловой кислоты с концентрацией 10 мкг/мл и кофейной кислоты с концентрацией 20 мкг/мл при различных скоростях подачи раствора через патрон. На основе полученных динамических кривых галловой и кофейной кислот установлены объемы «до проскока» каждого соединения при варьировании скорости подачи раствора.

6 Показана возможность концентрирования на сорбенте Диапак С18 галловой кислоты из отвара коры дуба, кофейной кислоты из отвара календулы аптечной, рутина из отвара подорожника большого, (-)-эпикатехина из отвара зверобоя продырявленного. Установлено, что концентрирование галловой и кофейной кислот из реального объекта является невозможным. В то же время, удалось достигнуть концентрирования рутина и (-)-эпикатехина из растительного образца.

Cписок использованных источников

1 Aaby, K. Сharacterization of phenolic compounds in strawberry (fragaria ananassa) fruits by different HPLC detectors and contribution of individual compounds to total antioxidant capacity / K. Aaby, D. Ekeberg, G. Ksrede // J. Agric. Food Chem. ? 2007. ? № 55. ? P. 4395-4406.

2 О влиянии биологически активных веществ на антиоксидантную активность фитопрепаратов / Шкарина Е.И и др. // Химико-фармацевтический журнал. - 2001. - т.35. - № 6. - С. 41-47.

3 Определение качественного состава коньячных изделий методом ВЭЖХ / Кочетова М.В. и др. // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2008. - Т.8. - Вып.4. - С. 658- 667.

4 Zheng, W. Antioxidant Activity and Phenolic Compounds in Selected Herbs / W. Zheng, S. Y. Wang // J. Agric. Food Chem. - 2001. - Vol. 49. - № 11. - P. 5165 - 5170.

5 Evaluation of the antioxidant properties of fruits / M. Garcэa-Alonso и др. // Food Chemistry. ? 2004. ? № 84. ? P. 13-18.

6 Liu, Q. Determination of seven polyphenols in water by high performance liquid chromatography combined with preconcentration / Q. Liu, W. Cai, X. Shao // Talanta. - 2008. - № 77. - P. 679-683.

7 Tsao, R. Separation procedures for naturally occurring antioxidant phytochemicals / R. Tsao, Z. Deng // Journal of Chromatography B. - 2004. - № 812. - P. 85-99.

8 Analytical separation and detection methods for flavonoids / E. de Rijke и др. // Journal of Chromatography A. - 2006. - № 1112. - P. 31-63.

9 Antioxidant properties of marigold extracts / G. S. Cetkovic и др. // Food Research International. - 2004. - № 37. - P. 643-650.

10 Phytochemical and antioxidant analysis of eight Hypericum tax from Central Italy / G. Sagratini и др. // Fitoterapia. - 2008. - № 79. - P. 210-213.

11 Zgorka, G. Application of conventional UV, photodiode array (PDA) and fluorescence (FL) detection to analysis of phenolic acids in plant material and pharmaceutical preparations / G. Zgorka, S. Kawka // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. - 2001. - № 24. - P. 1065-1072.

12 Suarez, B. Solid-phase extraction and high-performance liquid chromatographic determination of polyphenols in apple musts and ciders / B. Suarez, A. Picinelli, J.Mangas // Journal of Chromatography A. - 1996. - № 727. - P. 203-209.

13 Кудринская, В. Синтез и исследование сорбционных свойств полимеров с молекулярными отпечатками кверцетина / В. Кудринская, С. Дмитриенко, Ю. Золотов // Вестник Московского университета. Серия 2. Химия. - 2009. - V. 50. - № 3. - P. 156-163.

14 Сычев, К.С. Материалы и методы пробоподготовки в хроматографии: твердофазное концентрирование и адсорбционная очистка / К.С. Сычев, В.А. Даванков // 2004. - т.4. -Вып.1.

15 Сычов К.С. Методы высокоэффективной жидкостной хроматографии и твердофазной экстракции При информационной поддержке: Портал ANCHEM.RU «Аналитика - Мир Профессионалов» ЗАО «Найтек Инструментс» Москва.

16 Стыскин, Е.Л. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография / Е.Л. Стыскин, Л.Б. Ициксон, Е.В. Брауде // Москва, 1986.

17 Шатц, В. Д. Высокоэффективная жидкостная хроматография: Основы теории. Методология. Применение в лекарственной химии / В. Д. Шатц, О. В. Сахартова // Рига: Зинатне. - 1988. - 390 с.

18 Simultaneous determination of phenolic acids and flavonoids in Lyciumbarbarum Linnaeus by HPLC-DAD-ESI-MS / B. S. Inbaraj и др. // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. - 2010. - № 51. - P. 549-556.

19 SPE-HPLC method for the determination of four flavonols in rat plasma and urine after oral administration of Abelmoschusmanihot extract / X. Lai и др. // Journal of Chromatography B. - 2007. ? № 852. - P. 108-11.

20 Govindarajan, R. High-performance liquid chromatographic method for the quantification of phenolics in `Chyavanprash' a potent Ayurvedic drug / R. Govindarajan, D.Singh, A. Rawat // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. - 2007. - №43. - P.527-532.

21 Васияров, Г.Г. Концентрирующие патроны Диапак / Г.Г. Васияров, Г.С.Алексеева // Выпуск 2.

22 Naczk, M. Extraction and analysis of phenolics in food / M. Naczk, F. Shahidi // Journal of Chromatography A. - 2004. - № 1054. - P. 95-111.

23 Michalkiewicz, A. Solid-phase extraction procedure for determination of phenolic acids and some flavonols in honey / A. Michalkiewicz, M. Biesaga, Kr. Pyrzynska // Journal of Chromatography A. - 2008. ? № 1187. - P. 18-24.

24 Simultaneous isolation of Rutin and Esculin from plant material and drugs using solid-phase extraction / B. Buszewski и др. // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. ? 1993. ? Vol. 11. ? № 3. - P. 211-215.

25 Разделение и определение фенолкарбоновых кислот методом капиллярного зонного электрофореза с предварительным динамическим концентрированием на сверхсшитом полистироле / О. Медведева и др. // Журнал аналитической химии. - 2004. - Т. 59. - № 7. - С.752-759.

26 Сычов С. Н. Высокоэффективная жидкостная хроматография на микроволновочных хроматографах серии «Милихром». Орел, 2002.

27 Блажей, А. Фенольные соединения растительного происхождения / А. Блажей, Л. Шутый // Перевод с английского. Изд.:Мир, Москва,1977.

28 Беликов, В. В. Методы анализа флавоноидных соединений / В. В. Беликов, М. С. Шрайбер // М.: Фармация, 1970. - №1 - С. 66-71.

29 Данилова, Н. А. Определение дубильных веществ в корнях щавеля конского методом спектрофотометрии / Н. А. Данилова, Д. М Попов // НИИ фармации ММА им. Сеченова. - 2004. - № 2. - С. 179-182.

30 Земцова, Г. Н. Сравнительная оценка методов определения суммы флавоноидов в Р-витаминном комплексе / Г. Н. Земцова, А. Б. Дмитриев // М.: Фармация. - 1985. - С. 754-757.

31 Flavonoids separations by capillary electrophoresis. Effect of temperature and pH / B. F. de Simon и др. // Chromatographia. ? 1995. - V.41. ? № 7/8. - P. 389-392.

32 Analysis of antioxidant flavonoids from Asteraceae and Moraceae plants by capillary electrophoresis/ Sz. T. Kristo и др. // Chromatographia Supplement. - 2002. - V. 56. - Р. 121-126.

33 Extraction of flavonoids from garden (Salvia officinalis L.) and glutinous (Salvia glutinosa L.) sage by ultrasonic and classical maceration / D.Velicovic и др. // J. Serb. Chem. Soc.? 2007. ? № 72.? P.73 ? 80.

34 БубенчиковаВ. Н. Изучение фенольных соединений шалфея мутовчатого./В. Н. Бубенчикова, Ю. А. Кондратова// Башкирский химический журнал. - 2008. -Т. 15. - № 2. - С. 102 - 104.

35 Chen, H. Separation and determination of flavonoids and other phenolic compounds in cranberry juice by high-performance liquid chromatography / H. Chen, Y.Zuo, Y. Deng // Journal of Chromatography A. - 2001. - № 913. - P. 387-395.

36 Determination of free molecular phenolics and catechins in wine by solid phase extraction on polymeric cartridges and liquid chromatography with diode array detection/ M. del Alamo и др. // Journal of Chromatography A. - 2004. - № 1049. - P. 97-105.

37 Fractionation of polyphenols in hawthorn into polymeric procyanidins, phenolic acids and flavonoids prior to high-performance liquid chromatographic analysis / U. Svedstrom и др. // Journal of Chromatography A. - 2006. - № 1112. - P. 103-111.

38 The occurrence and characterisation of phenolic compounds in Camelina sativa seed, cake and oil / P. Terpinc и др. // Food Chemistry. - 2012. - № 131. - P. 580-589.

39 Simonetti, P. Caffeic Acid as Biomarker o f Red Wine Intake / P. Simonetti, C.Gardana, P. Pietta // Мethods in enzymology. - vol. - 335.

40 Separation of flavonol-3-0-glycosides from Calendula oficinalis and Sambucusnigra by high-performance liquid chromatography and miceller electrokinetic capillary chromatography / P. Pietta и др. //Journal of Chromatography. -1992. - № 593.

41 Determination of selected flavonoids in hop extract by HPLC / J. Kovacova и др. // Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. - 2011. - № 34. - P. 329-340.

42 Preparative Purification of the Major Flavonoid Glabridin from Licorice Roots by Solid Phase Extraction and Preparative High Performance Liquid Chromatography / Jiao Lv и др. // Separation Science and Technology. - 2010. - № 45. - P. 1104-1111.

43. Mothibedi, K. Determination of flavonoids in Ginkgo Biloba using Bond Elute Plexa solid phase extraction sorbent for cleanup and HPLC-DAD analysis / K. Mothibedi, J. Mokgadi, N. Torto // Agilent Technologies, Inc., 2011.

44 Цюпко, Т. Г. Оценка сумы биологически активных веществ фитоматериалов по величине антиоксидантной активности / Т.Г. Цюпко, З.А. Темердашев, О.Б. Воронова // Вестник Казахского национального университета. Серия Химия. - 2010. - Т. 60. - № 4. - С. 343-345

45 Determination of synthetic phenolic antioxidants in food items using reversed-phase HPL / B. Saad и др. // Food Chemistry. - 2007. - № 105. - P. 389-394.

46 Темердашев, З. А. Определение фенольных соединений и флавоноидов в водных экстрактах лекарственных растений / З. А. Темердашев, И. А. Колычев, Т. Г. Цюпко // Заводская лаборатория. - 2011. - № 6.

47 Solid-phase extractionand gas chromatographic analysis of phenolic compounds in virgin olive oil / L. Liberatore и др. // Food Chemistry. - 2001. - № 73. - P. 119-124.

48 Определение фенольных соединений и флавоноидов в водных экстрактах лекарственных растений / Темердашев З.А. и др. // Заводская лаборатория. - 2011. - № 11. - С. 18-22.

49 Курс физической химии / Под ред. Я. И. Герасимова. - М.: Химия, 1964. - 624 с.

50 Смирнова, О. В. Исследование адсорбции и десорбции феноксикарбоновых кислот на поверхности кремнезема / О. В. Смирнова // Наносистемы, наноматериалы, нанотехнологии. - 2008. - Т. 6. - № 1. - С. 291-302.

Приложения

Рисунок 1 - Хроматограмма отвара тысячелистника обыкновенного

Рисунок 2 - Хроматограмма отвара тысячелистника обыкновенного, пропущенного через сорбент С18

Рисунок 3 - Хроматограмма отвара тысячелистника обыкновенного, пропущенного через сорбент ССПС

Рисунок 4 - Хроматограмма отвара тысячелистника обыкновенного после этилацетатной экстракции

Рисунок 5 - Хроматограмма отвара зверобоя продырявленного

Рисунок 6 - Хроматограмма отвара зверобоя продырявленного, пропущенного через сорбент С18

Рисунок 7 - Хроматограмма отвара зверобоя продырявленного, пропущенного через сорбент ССПС

Рисунок 8 - Хроматограмма отвара зверобоя продырявленного после этилацетатной экстракции