Адаптация некоторых животных к среде обитания

Дипломная работа

Адаптация некоторых животных к среде обитания

Введение

Актуальность темы. Техногенная нагрузка на природные гидробиоценозы, состоящая в основном в повышении сапробности и токсического загрязнения водной среды, к настоящему времени стала одним из ведущих факторов, определяющих условия существования водных организмов, а именно, химический состав воды и грунта, качество кормовой базы, а в конечном итоге, видовой состав и численность. Эти параметры являются причиной изменения облика водоема, превращения его в другой тип экосистемы. Естественные смены типа экосистем в природе также имеют место, например, вследствие постепенного эвтрофирования, большинство стоячих и очень медленно текучих водоемов постепенно превращаются или уже превратились в болота.

Высокие темпы индустриализации, породили целый ряд проблем, связанных с изменением качества окружающей среды. Водные организмы, как известно, являются удобными объектами при оценке степени влияния на живой организм ксенобиотиков, в том числе токсикантов, а значит, и качества среды. Они аккумулируют неблагоприятные эффекты комплекса различных воздействий, имеют сравнительно большие размеры и продолжительность жизни, обладают устойчивостью к сублетальным воздействиям различных веществ, могут быть использованы для прогноза различного рода воздействий на водные экосистемы [Немова, 2004].

Популяции водных животных также постоянно меняются и не только по численности образующих их особей того или иного вида, но и по качественному составу особей, что является следствием естественного отбора. Предпосылками естественного отбора являются наследственность и изменчивость, а факторами - вся совокупность условий обитания и, в частности, токсическое загрязнение водной среды, индуцирующее сначала индивидуальную адаптацию, затем определяющее преимущество той или иной совокупности морфо-функциональных и физиолого-биохимических признаков (точнее, нормы реакции) определенных особей, а затем и отбор, направленный на сохранение наиболее приспособленных к новым условиям существования особей в популяции, т.е. микроэволюцию.

Разобраться в сущности этих изменений можно, используя генетические маркеры изменчивости, в частности, первичную структуру участков некодирующей ДНК, которые принято выявлять с помощью метода ПЦР с последующим электрофоретическим разделением в агарозном или полиакриламидном гелях. Данные последовательности не связаны с функциональным геномом, а потому не испытывают действия отбора и сохраняются в наследственном материале, формируя индивидуальную карту «личности», своего рода «отпечаток пальцев», по которым в совокупности можно оценивать полиморфизм популяций и исследовать степень его выраженности в разных популяциях в качестве признака изменчивости генома в определенных условиях существования.

Последнее положение требует основательной проверки и составляет основное содержание предлагаемой работы, однако, косвенные обоснования его справедливости имеются в литературе. В молекулярной генетике уже довольно давно исследуют некодирующую ДНК в качестве источника информации об индивидуальных особенностях генома, не осложненных взаимодействием с внешней средой. На основании этой информации обычно проводят генеалогические расчеты, свидетельствующие о степени эволюционной близости популяций, видов и более крупных таксонов, которые имеют проблематичное толкование. Только получив требуемую информацию в комплексе, мы сможем объективно оценивать влияние техногенной нагрузки на микроэволюцию видов с учетом их индивидуальной и наследственной адаптации к токсическому воздействию на организм.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение межпопуляционного полиморфизма пресноводных видов моллюсков, обитающих в разных экологических условиях.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Выбрать наиболее подходящий объект для изучения внутривидовой дифференциации из числа пресноводных гидробионтов.

2. Выбрать водоемы на территории Москвы и Московской обл., наиболее доступные для сбора материала и разнообразные по своим эколого- гидрологическим условиям.

3. Подобрать оптимальные условия для молекулярного маркирования (на основе ПЦР как наиболее доступного метода анализа полиморфизма ДНК) внутривидового геномного полиморфизма пресноводных моллюсков и метод статистической обработки данных.

4. Изучить степень различия изолированных популяций собранных видов и выявить факторы, влияющие на процесс внутривидовой дифференциации и микроэволюцию пресноводных гидробионтов.

Научная новизна работы. Для изучения межпопуляционного полиморфизма живородки речной впервые был применен метод молекулярного маркирования на основе ПЦР. Водоемы, выбранные для исследования, впервые подверглись оценке по степени загрязненности донных отложений.

Исследован внутривидовой полиморфизм брюхоногого моллюска живородка речная (Viviparus viviparus L.) по наборам полиморфных ПЦР- фрагментов геномной ДНК. Проанализирован характер дифференциации популяций в открытых водоемах Московской области, и установлено, что основное влияние на сходство и различия в популяциях моллюсков оказывают не только техногенные факторы, но и в не меньшей степени биотические и абиотические факторы среды, а также географическая локализация популяций.

Практическая значимость работы.

Данные молекулярного полиморфизма популяций видов, обитающих в водоемах, различных по своим характеристикам, по набору ПЦР фрагментов геномной ДНК с использованием молекулярных маркеров позволяют провести мониторинг их экологического состояния, а также спрогнозировать развитие биоценозов в условиях техногенной нагрузки, что поможет объяснить молекулярно- генетическую эволюцию видов, подвидов и микроэволюцию отдельных популяций.

Кроме того, возможно характер внутривидовой дифференциации моллюсков отражает процесс возникновения и эволюции водоемов, поэтому данные анализа молекулярно-генетического полиморфизма моллюсков могут быть использованы для выявления истории возникновения и развития водоемов в случаях, когда этот процесс не выяснен и представляет научный интерес.

водоем полиморфизм пресноводный мутационный

Глава 1. Адаптация животных организмов к загрязнению среды обитания

1.1 Основные источники загрязнения

Тяжелые металлы. Группу тяжелых металлов можно отнести к микроэлементам, в этом ряду одни крайне необходимы для жизнеобеспечения живых организмов, другие вызывают противоположный эффект и, попадая в организм, приводят к его отравлению или гибели. [Небел, 1993]. Основное внимание уделяется тяжелым металлам, имеющим удельную плотность свыше 5 г/см3 - ртуть, медь, никель, кобальт, свинец, цинк, кадмий, хром, олово. К этой группе по своим свойствам примыкает мышьяк. При некоторых условиях и другие металлы (например - алюминий, сурьма, титан и др.) могут проявлять высокую токсичность. Источником загрязнения окружающей среды металлами являются предприятия горнорудной, металлургической отраслей промышленности, энергетики и транспорт [Филенко, 2007].

Важной особенностью металлов является устойчивость загрязнения. Сам элемент разрушиться не может, переходя из одного соединения в другое или перемещаясь между жидкой и твердой фазами. Возможны окислительно- восстановительные переходы металлов с переменной валентностью. Перемещение металлов возможно через атмосферу в связи с летучестью некоторых металлов или их соединений (Pb, As, Sn, Zn, Cd, Hg, Cu, Se) и через воду в связи со способностью образовывать в естественных условиях растворимые соединения (As, Zn, Cd, Сu, Se, Сг). Все металлы и их соединения способны адсорбироваться и переноситься взвешенным в природных водах ве- ществом. Со временем происходит депонирование металлов в донных осадках [Филенко, 2007].

Металлы в растворенной фракции могут находиться в виде гидратированных ионов, неорганических и органических соединений и комплексов, в том числе с хелатообразователями, гуминовыми, фульвовыми кислотами, полисахаридами, всегда присутствующими в природных водах.

Нефть и нефтепродукты. Любая нефть представляет собой сложную смесь алканов (парафиновых и ациклических насыщенных углеводородов), цикланов (нафтенов) и ароматических углеводородов, кислородных, сернистых и азотистых соединений, меркаптанов, сульфидов, пиридинов, гидропиридинов, гидрохинолинов, воды, минеральных солей.

На живые организмы нефть оказывает комплексное действие, как механическим путем, так и за счёт отравления компонентами, обладающими биологической активностью (растворимыми в воде компонентами).

Пестициды. Ядохимикаты до настоящего времени остаются необходимым средством борьбы с организмами, повреждающими промышленную и сельскохозяйственную продукцию, строения и сооружения, служащими переносчиками или хозяевами возбудителей различных заболеваний. Некоторые ядохимикаты - биоциды - специально созданы для вмешательства в ход биологических процессов в водной среде. Среди них могут быть выделены альгициды - средства подавления водной растительности, моллюскоциды - средства уничтожения моллюсков- переносчиков паразитарных заболеваний, ихтиоциды - средства воздействия на популяции рыб, считающихся сорными, сляймициды - средства предотвращения обрастаний материалов слизеобразующими организмами, и др.

В составе большинства пестицидов, выделяется лишь несколько химических групп, к которым эти соединения относятся. Это группы хлорорганических, фосфорорганических, металлорганических соединений, производные карбаминовой кислоты и мочевины.

Полихлорированные бифенилы (ПХБ). Эти соединения широко использовались во многих странах мира в качестве диэлектриков, антифризов, наполнителей гидравлических систем, пластификаторов. Загрязнения возможны при утечках в процессе их производства и применения. Особенностью этих соединений является их низкая химическая активность и, как полагают, отсутствие токсичности для млекопитающих. В связи с этим применение таких веществ не было обусловлено необходимыми мерами предосторожности [Парк, 1973; Филенко, 2007].

Диоксины. Обычно эти соединения являются побочным продуктом некоторых химических производств и присутствуют в качестве примесей к хлорорганическим пестицидам. Диоксины отличаются необычайно высокой стабильностью в окружающей среде и сродством к липидам тканей организмов. Эти свойства определяют высокую накопительную способность этих соединений [Парк, 1973; Филенко, 2007].

Синтетические поверхностно-активные вещества (СПАВ). СПАВ характерны тем, что каждая молекула такого вещества имеет фрагменты, обладающие разной способностью к растворению в полярных и неполярных растворителях. В стиральные порошки входят линейные алкилированные сульфонаты (ЛАС), заместившие ранее использовавшиеся аикилбензенсульфонаты, основные и анионные ПАВ. Хотя ЛАС быстрее разрушаются в растворах, их токсичность несколько выше.

ПАВ относительно устойчивы в окружающей среде и в организме животных. В некоторых загрязняемых природных водах уровень ПАВ может достигать 5 мг/л.

Использование СПАВ в качестве эмульгаторов при борьбе с утечками нефти с точки зрения экологии недопустимо, так как это приводит к повышению концентрации чужеродного агента в окружающей среде в дополнение к нефти и к повышению растворимости в воде токсичных компонентов нефти.

Компоненты и отходы сырья биологического происхождения.

Со сточными водами или при специальном применении в водные объекты могут попадать и такие ядовитые веществам растительного происхождения как алкалоиды: никотин, анабазин, кофеин, стрихнин, атропин, кониин, телепатин.

Это группа азотистых соединений, обладающих основными свойствами, в большинстве своем являются сильными ядами, но в малых дозах используются в качестве лекарственных веществ. Токсичными для гидробионтов оказываются широко распространенные в природе, в соке и смоле хвойных деревьев камфора, тимол и другие терпены (непредельные углеводороды), а также эфирные масла из сосновой смолы и канифоли. Эти вещества загрязняют воду в результате лесосплава или при попадании в воду листового и хвойного опада. Все они действуют преимущественно как нервные яды. Смола растений (особенно из хвои сосны) состоит из смеси смоляных кислот, древесного спирта, ароматических альдегидов, эфирсодержащих масел и других соединений. Токсичными для рыб являются продукты выщелачивания древесины и коры, продукты, выделяемые из хвойной смолы и ягод, например, эфирные масла туи.

Помимо этих основных групп, важность для токсикологии может представлять появление в водной среде продуктов хлорирования и отходов химических производств, родственные по структуре и своему биологическому действию некоторым пестицидам.

1.2 Условия и механизмы возникновения адаптации

Жизнь в водоеме, в отличие от наземных условий, характеризуется большей зависимостью гидробионтов от факторов среды. Поэтому водные экосистемы, сообщества, организмы особо чувствительны к нарушению химического состава среды. Проблемы, возникающие при изменении внешних условий, и потенциальные средства, с помощью которых данный организм может избежать вредных последствий этого изменения, непосредственно зависят от того, насколько быстро изменяется внешняя среда. Как правило, чем быстрее происходит изменение, тем сильнее будет его воздействие на организмы. Чем большим временем располагает организм для адаптации, тем более основательно он может перестроить свои фундаментальные биохимические механизмы.

При изучении изменений, происходящих в организме под влиянием совокупности экологических (природных и антропотехногенных) факторов, применяют термин «адаптация».

Под адаптацией понимают все виды врождённой и приобретённой приспособительной деятельности, которые обеспечиваются физиологическими реакциями, происходящими на клеточном, органном, системном и организменном уровнях. Адаптация тесно связана с эволюцией организмов и устойчиво адаптированными считаются те, которые приспособились к изменённым условиям, размножаются и дают в новой среде обитания жизнестойкое потомство. Существуют две принципиально различные формы адаптации: генотипическая и фенотипическая.

Генотипическая адаптация характеризуется, прежде всего, тем, что на основе наследственности, мутаций и естественного Отбора происходит формирование современных видов животных и растений. Генотипическая адаптация стала основой эволюции потому, что ее «достижения» закреплены генетически и передаются по наследству.

Следующей формой адаптации, приобретаемой в ходе индивидуального развития, является фенотипическая адаптация, формирующаяся в процессе взаимодействия особи с окружающей средой и обеспечивающаяся глубокими структурными изменениями организма. Фенотипическую адаптацию можно охарактеризовать как процесс, в результате которого организм приобретает отсутствовавшую ранее устойчивость к определенному фактору внешней среды и таким образом получает возможность жить в условиях, ранее не подходящих для обитания. При первой встрече с новым фактором среды в организме нет готового, вполне сформированного механизма, обеспечивающего современное приспособление. Имеются только генетически детерминированные предпосылки для формирования такого механизма.

Иными словами, генетическая программа организма предусматривает не заранее сформировавшуюся адаптацию, а возможность ее реализации под влиянием среды. Это обеспечивает реализацию только тех адаптационных реакций, которые жизненно необходимы. В связи с этим следует считать выгодным для сохранения вида тот факт, что результаты фенотипической адаптации не передаются по наследству. В быстро меняющейся среде следующее поколение каждого вида рискует встретиться с совершенно новыми условиями, в которых потребуется не специализированные реакции предков, а потенциальная, оставшаяся, до поры и времени неиспользованная возможность адаптации к широкому спектру факторов.

Различают три типа приспособительного поведения живых организмов в ответ на действие неблагоприятного раздражителя: бегство от неблагоприятного раздражителя, пассивное подчинение раздражителю либо активное противодействие за счёт развития специфических адаптивных реакций. Система жизнеобеспечения организма, наряду с механизмами поддержания равновесия внутренней среды (гомеостаз), представлена и генетическими программами развития, осуществление которых невозможно без постоянного изменения этой внутренней среды (гомеокинез), реализуемого посредством многообразных адаптивных процессов (реакций, механизмов, ответов и т.д.). Именно на поддержание генетических программ развития, являющихся ведущей движущей силой в живом организме, направлена деятельность систем репродуктивного, энергетического и адаптационного гомеостата [Григорьев, 2008].

Любой токсический фактор вызывает развитие стресса, который сопровождается закономерными фазными изменениями биохимических показателей организма. Динамика большинства биохимических процессов при стрессе проходит три основные закономерные фазы, описываемые S- образной адаптационной кривой Селье.

К настоящему времени накоплен достаточно большой материал о реакции различных биохимических показателей, а также о чувствительности ферментных систем на изменения тех или иных условий окружающей среды или на присутствие токсических факторов.

Селье назвал факторы, воздействие которых приводит к адаптации, стресс-факторами. Другое их название - экстремальные факторы. Экстремальными могут быть не только отдельные воздействия на организм, но и изменённые условия существования в целом. Всю сумму разнообразных воздействий на животных принято делить на две категории: летатьные и сублетальные. Воздействие летальных факторов несовместимо с жизнью, приспособление к ним невозможно. Жизнь при действии сублетальных факторов возможна за счет перестройки физиологически адаптивных механизмов, которыми располагает сам организм. При чрезмерной силе и длительности действия раздражителя сублетальный фактор может перейти в летальный.

По времени развития адаптация может быть срочной и долговременной. Срочная адаптация - немедленный ответ организма на действие внешнего фактора - осуществляется путем ухода от фактора (избегание) или мобилизацией функций, которые позволяют существовать, несмотря на действие фактора. Такого рода биохимическая адаптация происходит настолько быстро, что она не может быть связана с изменениями в экспрессии генов или со значительной перестройкой клеточных структур в результате биосинтетических процессов. Немедленная адаптация нередко осуществляется путем модуляции активности уже имеющихся ферментов. У целого ряда видов животных различных систематических групп (черви, моллюски, рыбы) наблюдаются колебания активности ферментов при токсическом воздействии на организм [Цветков, 2009; 2013]. Такая быстрая «подгонка» активности ферментов часто представляет собой лишь первую линию защиты организма от неблагоприятных воздействий окружающей среды. Со временем на смену этой реакции приходят изменения в экспрессии генов или - в ряду поколений - изменения на генетическом уровне.

Долговременная адаптация - это постепенно развивающийся ответ организма на многократное или длительное действие внешнего фактора. Она обеспечивает осуществление реакций, которые ранее были невозможны в условиях, несовместимых с жизнью [Григорьев, 2008].

Адаптация начинает развиваться на фоне активации неспецифического, а также специфического ответа на причинный фактор. В последующем формируются функциональные системы, позволяющие организму либо избежать действия раздражителя, либо преодолеть его неблагоприятное воздействие, либо обеспечивающие оптимальный уровень жизнедеятельности, несмотря на продолжающееся влияние этого агента.

Рассмотрение биохимической адаптации необходимо начать с анализа фундаментальных механизмов. Существует три типа адаптивных механизмов:

1. Приспособление макромолекулярных компонентов клеток организма. Существует два вида такого приспособления:

1) изменение концентрации уже имеющихся типов макромолекул, например, ферментов;

2) образование макромолекул новых типов, например, новых изозимов и аллозимов, которыми замещаются макромолекулы, ранее имевшиеся в клетке, но ставшие не вполне пригодными для работы в изменившихся условиях.

2. Приспособление микросреды, в которой функционируют макромолекулы. Сущность этого механизма состоит в том, что адаптивное изменение структурных и функциональных свойств макромолекул достигается путем видоизменения качественного или количественного состава окружающей их среды (например, ее осмотической концентрации или состава растворенных веществ). Этот механизм имеет исключительно большое значение и дополняет макромолекулярную адаптацию.

3. Приспособление на функциональном уровне, в том случае, когда изменение эффективности макромолекулярных систем, в особенности ферментов, не связано с изменением числа имеющихся в клетке макромолекул или их типов. Адаптацию в этом случае обеспечивает изменение в использовании уже существующих макромолекулярных систем в соответствии с текущими локальными потребностями в той или иной метаболической активности. Таким образом, из этих адаптаций складывается важное явление метаболической регуляции [Хочачка, 1988].

Если условия среды изменяются или организм переходит на новую стадию развития, возникают новые метаболические задачи, для решения которых могут понадобиться количественные и качественные преобразования ферментных систем, упоминавшиеся выше. Например, у эктотермного организма (температура тела которого в основном или даже полностью определяется температурой окружающей среды) при понижении внешней температуры может сильно понизиться общая интенсивность метаболизма и измениться регуляция ряда ключевых ферментов.

В определенной мере эти отклонения могут быть компенсированы повышением концентрации ферментов в клетке. Однако в некоторых случаях одного увеличения этих концентраций бывает недостаточно: может случиться так, что для восстановления адекватной каталитической и особенно регуляторной способности ферментов клетке потребуется синтезировать новые изозимы. К примеру, изучение молекулярных форм кислой фосфатазы в печени рыб при температурных адаптациях показало, что пониженная температура в среде обитания вызывает модификации спектра изоформ фермента. Так, у карпа адаптация к холоду приводит к перераспределению активности кислой фосфатазы между отдельными молекулярными формами в сторону увеличения активности низкомолекулярных гетероформ и заметному снижению активности высокомолекулярной формы.

Временные параметры биохимической адаптации варьируют в широких пределах - от длительных периодов, необходимых для эволюционного изменения аминокислотных последовательностей, до долей секунды, за которые может измениться активность уже присутствующих в клетке ферментов. Чем больше времени предоставляется для адаптивных изменений, тем больше выбор возможных стратегий.

В тех случаях, когда адаптивный процесс идет на протяжении многих поколений, популяция может использовать все стратегии приспособления. Мутации регуляторных генов приведут к изменению базальных концентраций ферментов и других молекул, т. е. к количественной макромолекулярной адаптации. Аминокислотные замены в белках обусловят появление новых изозимов, а в особых случаях - и ферментов совсем нового типа. Замены аминокислот могут облегчить выработку новых способов регуляции ферментативной активности, обеспечивающих более адекватную реакцию на сигналы, вызывающие изменения в скоростях метаболических процессов. При генетической адаптации могут также возникать совершенно новые молекулы, придающие организму способность к освоению новых местообитаний. Классическим примером такого рода адаптаций может служить появление гликопротеиновых и полипептидных «антифризов» у морских костистых рыб, живущих в высоких широтах, благодаря чему эти рыбы (в отличие от других костистых рыб) могут существовать в условиях пониженных температур.

Таким образом, организм располагает способами адаптации разной степени сложности, которые позволяют ему успешно приспосабливаться к изменениям окружающей среды.

1.3 Биохимическая адаптация

Молекулярно-биохимические факторы адаптации. Металлотионеины и стресс-белки.

Исследования, направленные на изучение накопительной способности пресноводных моллюсков, показали, что моллюски обладают определёнными механизмами детоксикации, которые служат для ограничения или устранения токсического вещества организма. Следует отметить, что во избежание повреждения клеточных структур при попадании в организм моллюсков тяжёлых металлов активизируются транспортные системы, которые способствуют перераспределению металла таким образом, что через короткое время большая часть металла оказывается связанной со специфическими белками металлотионеинами.

Связывание тяжелых металлов в различные бионеорганические комплексы происходит мгновенно при введении металлов в организм любым способом и в любой концентрации. По данным исследований, связывание ТМ с МТн в прочные комплексы происходит в основном в гепатоцитах. Это связывание помогает снизить гепатотоксическое действие ТМ.

Природная функциональная роль MTн заключается в гомеостазе цинкa и токсичных ТМ, а также МТн играет сигнальную и регулирующую роль. MTн также может участвовать в модуляции иммунных реакций. Эндогенный MTн способен модулировать иммунную реакцию in vivo, а внутриклеточный MTн модулирует иммунную функцию регулированием активности фактора транскрипции. Эти закономерности наблюдаются не только у животных разной степени сложности (от дафний и дрозофил до млекопитающих и человека), но даже у растений [Пыхтеева, 2009].

Пространственные структуры МТн млекопитающих, МТн ракообразных были получены методами двумерной ЯМР-спектроскопии и рентгеновской кристаллографии. Несмотря на то, что аминокислотные последовательности МТн разных видов различны, они имеют сходные пространственные структуры. МТн имеют гантелеподобную форму с двумя отдельными белковыми доменами, с основными узлами, созданными несколькими тетраэдрическими Me(II)Cys единицами. Все Cys включаются в связывание металлов. МТн не содержат почти никаких правильных элементов вторичной структуры [Пыхтеева, 2009].

Основная активность металлотионеинов в клетках направлена на то, чтобы в ответ на высокое содержание токсичных металлов произвести защитную реакцию. В случае пониженной концентрации катиона металла или его полном отсутствии синтез защитных белков не усиливается.

В основном осуществляется синтез металлотионеинов Сd, Zn, Cu, Hg, Au, Ag, Co, Ni, Pb, однако существенно различается количество защитных белков, образовавшихся в ответ на разные группы металлов. Некоторые металлы не вызывают образования защитных белков, например, Ca, Al, Na, Mg, U. Индуцировать синтез металлотионеинов могут не только тяжелые металлы, но и другие стресс-факторы, например: клеточное голодание, различные инфекции, повышенное содержание активных форм кислорода, воздействие проникающей радиации и химические соединения, в том числе и вещества, обладающие биологической активностью [Стручкова, 2011].

При продолжающемся поступлении металлов в ткани происходит их фиксация на неподвижных белковых образованиях в тканях паренхимы или внешних покровов.

В животном организме помимо металлотионеинов существует множество белков, индукция экспрессии которых происходит в стрессовом состоянии, обычно именуемых белками теплового шока (БТШ) или heat shock proteins (HSP). В дальнейшем их стали называть молекулярными шаперонами (цит. по [Цветков, 2013]).

Белки теплового шока образуются в клетках в ответ на действие температурного стресс-фактора, в том случае, когда подавлена экспрессия основного пула белков, участвующих в нормальном метаболизме.

Различают три главных семейства БТШ, отличающихся значениями молекулярных масс - 25, 70 и 90 кДа (hsp25, hsp70 и hsp90). Белки каждого из этих семейств широко распространены в здоровых клетках организма и способны денатурированные и неправильно свернутые белки переводить в раствор и сворачивать обратно правильным способом.

Так, при исследовании стрессового воздействия температурного и токсического факторов на амфипод было выявлено, что экспозиция амфипод при повышенной температуре вызывает многократное увеличение содержания нмБТШ даже у тех видов, у которых отсутствует конститутивный синтез нмБТШ.

Экспонирование амфипод в растворах CdCl2 различной концентрации также вызывает увеличение содержания нмБТШ, при этом максимальное количество исследуемого нмБТШ наблюдали в растворах с наибольшей концентрацией токсиканта, минимальное - с наименьшей [Шатилина, 2010].

К БТШ с молекулярной массой 70 кДа (БТШ-70 эукариот и DnaK прокариот) относятся белки, играющие важную роль как в выживании клетки в условиях стресса, так и при нормальном метаболизме. Уровень гомологии семейств данных белков при полном сходстве отдельных доменов у про- и эукариот, превышает 50%. 70 кДа БТШ являются одной из самых консервативных групп белков в природе, что скорее всего обусловлено шаперонными функциями, которые данные стресс-белки выполняют в клетках. К семейству стрессорных белков с молекулярной массой около 70 кДа принадлежат как конститутивные белки, постоянно присутствующие в клетках, так и индуцибельные белки, синтезируемые при стрессорных воздействиях. Так, в жабрах моллюсков Mutilus edulis выявлен конститутивный белок теплового шока Hsp70. При изменении солености воды уровень Hsp70 в клетках жаберного эпителия мидий повышается по сравнению с контролем (цит. по [Цветков, 2013]).

Белки теплового шока кодируются семейством эволюционно устойчивых генов, которые способны подвергаться экспрессии в ответ стрессовые воздействия окружающей среды и участвовать в процессах адаптации. БТШ вовлечены в большинство физиологических процессов всех живых организмов и являются компонентами единого сигнального механизма. Стресс-белки в комплексе с растущей полипептидной цепью, предотвращают ее неспецифическую агрегацию и деградацию от действия внутриклеточных протеиназ, способствуя правильному фолдингу белков, происходящему с участием других шаперонов. Hsp70 принимает участие в ATФ-зависимом разворачивании полипептидных цепей, делая неполярные участки полипептидных цепей доступными действию протеолитических ферментов.

Ферментативная детоксикация ксенобиотиков/

Для преобразования многих органических токсичных веществ в тканях и клетках организмов формируются неспецифические биохимические механизмы. Однако превращение большинства соединений, особенно - на первых этапах интоксикации - осуществляется с участием ферментов нормального метаболизма. Детоксикация обеспечивается прохождением реакций окисления, восстановления, гидролиза, в результате чего оказываются связанными или разрушенными химически активные группы чужеродных молекул, и повышается их полярность [Филенко, 2007].

Метаболизм ксенобиотиков проходит в две фазы. В ходе первой фазы к молекуле поллютанта либо присоединяются полярные функциональные группы, либо осуществляется экспрессия таких групп, находящихся в субстрате в скрытой форме. Это может достигаться за счет ферментативных окислительно-восстановительных или гидролитических реакций, в ходе которых молекула становится более реакционноспособной и гидрофильной. Во второй фазе происходят процессы биологической конъюгации промежуточных продуктов метаболизма с эндогенными молекулами (глутатион, глюкуроновая кислота, сульфат и т. д.), в результате чего липофильный и, следовательно, трудно выводимый ксенобиотик становится гидрофильным продуктом, что обусловливает возможность его быстрой экскреции. Механизм реакций конъюгации предусматривает обязательное участие в этих процессах макроэргов - соединений, богатых энергией. Значительная часть этих реакций протекает на мембранах эндоплазматической сети клеток, непосредственно в месте образования высокореактивных метаболитов при действии оксидаз со смешанными функциями (цит. по [Цветков, Коничев, 2013]).

Классическим примером биотрансформации ксенобиотиков является метаболизм бензола в организме. В ходе l-й фазы метаболизма липофильный субстрат превращается в полярный продукт путем включения в молекулу гидроксильной группы. В ходе 2-й фазы фенол взаимодействует с эндогенным сульфатом, в результате полярность образующегося продукта еще более возрастает, и водорастворимый фенилсульфат легко выводится из организма.

Среди реакций микросомального окисления особым вниманием пользуются реакции гидроксилирования с участием кислорода, НАДФН и кислородактивирующего компонента микросомальных оксидаз смешанного действия - цитохрома Р450.

Цитохром Р450 является важнейшим компонентом микросомальной монооксигеназной системы, ответственным за активацию молекулярного кислорода и связывание субстрата. Помимо цитохрома Р450 в состав этой системы входят НАДФН-цитохром Р450-редуктаза, цитохром b5 и НАДН- цитохром b5-редуктаза.

Микросомальная фракция печени рыб имеет активную систему гидроксилазы арильных углеводородов нефти. Существование такой системы у организмов зоопланктона не доказано. Полагают, что единственным процессом детоксикации арильных углеводородов у организмов зоопланктона является их выведение. Вместе с тем у ракообразных проявляется оксигеназная активность против нафталина, являющегося компонентом нефти, хотя и менее активная, чем у рыб и млекопитающих.

Изоферменты.

К биохимическим тест-системам, пригодным для оценки окружающей среды относятся, прежде всего, ферменты, как универсальные катализаторы и регуляторы обменных процессов в живой природе. Именно с регуляции метаболических процессов формируются первичные адаптивные реакции организма.

В настоящее время имеются указания на дифференциальную изменчивость белков и ферментов. Показано, что ферменты с широкой субстратной специфичностью, использующие в качестве субстратов вещества, поступающие в клетку извне, приблизительно вдвое более вариабельны, чем ферменты, использующие в качестве субстратов внутриклеточные метаболиты.

Таким образом, становится возможным использование изоферментов при изучении генетической структуры популяций. Генетические различия между популяциями для многих видов рыб были продемонстрированы с использованием изоферментов.

Согласно гипотезе Ю.П. Алтухова и Ю.Г. Рычкова, мономорфные биохимические признаки связаны с жизненно важными функциями, остающимися неизменными в меняющейся среде благодаря выработке структурной множественности родственных белковых компонентов, ответственных за реализацию этих функций, и благодаря системам генетического полиморфизма, обеспечивающим широкую адаптацию.

Применение множественных форм ферментов открыло новые возможности для геногеографии. В настоящее время определение типов географической изменчивости аллельных частот является одним из применений изоферментов в качестве генетических маркеров в эволюционной биологии. Факты постепенного изменения в том или ином направлении аллельных частот на ареале вида сразу же привлекли внимание исследователей. Вероятно, географический градиент частот связан с изменениями факторов среды. На эту тему было проведено много специальных исследований, особенно на рыбах.

Один из первых и принципиально важных примеров был обнаружен при изучении эстеразы сыворотки крови у пресноводной рыбы чукучана Catostomus clarkii. Эстеразный локус был представлен в популяциях этого вида двумя аллелями: один из них более часто встречался в южных популяциях, а другой в северных. Было высказано предположение, подтвердившееся позднее, что температура среды может быть существенным компонентом отбора, действующего через гетерозис по этому локусу.

В лабораторных условиях был проведено исследование выживаемости Drosophila melanogaster с генотипическими различиями по локусу алкогольдегидрогеназы при холодовом и тепловом шоке. В условиях опыта с тепловым шоком смертность достигала 90%, при этом она носила дифференциальный характер, так как происходил сдвиг аллельных частот в сторону того аллеля, который чаще наблюдается в части ареала с более высокой температурой. Сходные результаты были получены при изучении температурных воздействий на разные генотипические классы по локусу лактатдегидрогеназы Anoplarchus purpurescens (цит. по [Цветков, 2013]).

Косвенным свидетельством адаптивной природы биохимического полиморфизма является также дифференциальная изменчивость локусов, контролирующих ферменты с различными физиологическими функциями. Тот факт, что ферменты, катализирующие реакции в различных метаболических путях (например, в утилизации глюкозы), в среднем значительно менее полиморфны, чем ферменты с широкой субстратной специфичностью, объясняется тем, что для ферментов первой группы характерны субстраты, образующиеся в серии последовательных реакций и постоянные по своему составу, тогда как для второй группы субстраты (спирты, эфиры) поступают в основном из окружающей среды, и, следовательно, ферменты, использующие их, должны быть более гетерогенны. Таким образом, более высокая степень изменчивости ферментов с широкой субстратной специфичностью может рассматриваться как прямая адаптация к изменениям в условиях среды.

1.4 Молекулярно-генетический уровень адаптации

Особенности организации генома эукариот/

Геном эукариот по ряду признаков значительно отличается от генома прокариот, наиболее важным из которых является его избыточность. В эукариотической клетке содержится гораздо больше генов, чем в прокариотической. Объяснить повышенное содержание ДНК в эукариотическом геноме только лишь потребностью в дополнительной генетической информации вследствие усложнения организации нельзя, потому что большая часть его геномной ДНК в основном представлено некодирующими последовательностями, не несущими наследственной информации о белках и РНК. Несоответствие между размером генома и фенотипической сложностью организма, который им обладает, получило название «парадокса C».

Несмотря на то, что суммарный размер генома эукариот не зависит от их фенотипической сложности, эволюционный переход от прокариот к эукариотам сопровождался увеличением общего количества генов в их геномах. При этом большие различия в фенотипической сложности высших эукариот, имеющих приблизительно одинаковое число генов, примерно равное 104 («парадокс N»), в настоящее время пытаются объяснить уникальной комбинаторикой объединения универсальных экзонов их генов (и доменов белков) в филогенезе и во время экспрессии генов. Для геномов эукариот характерно наличие разнообразных типов повторяющихся нуклеотидных последовательностей. К ним относятся часто повторяющиеся, умеренно повторяющиеся и уникальные.

Часто повторяющиеся последовательности (сателлиты). Сателлитные НП, содержание которых в геноме эукариот может достигать 5- 50% от суммарного количества ДНК, представляют собой очень длинные (в несколько сотен т.п.н.) участки ДНК с тандемно («голова к хвосту») повторяющимися короткими блоками (5-200 п.н.).

Высокополиморфные ДНК, в состав которых входят тандемные повторы размером 1-4 п.н., называемые микросателлитами, организованы в блоки до 200 п.н. и встречаются в различных частях генома. Гомополимерные микросателлиты типа (A)n/(T)n, представляющие собой остатки ретротранспозонов, часто присутствуют в геномах животных. Напротив, гомополимеры типа (G)n/(C)n у животных крайне редки. В геноме животных достаточно часто встрчаются динуклеотидные минисателлиты типа CA/GT или CT/GA, в среднем, через каждые 20-50 т.п.н. Довольно редко в геномах животных распространены три- и тетрануклеотидные микросателлиты. Длина микросателлитов и их общее количество в геноме зависит от его размера у различных классов живых организмов.

Сателлитные ДНК размером 5-50 п.н. называются минисателлитами, они образуют блоки промежуточных размеров до 104 п.н. Макросателлитные нуклеотидные последовательности ДНК отличаются большим размером повторяющейся единицы (более 1000 п.н.). Они обнаружены, в частности, в W-хромосомах птиц, в геноме кошек и человека [Патрушев, 2007]

Умеренно повторяющиеся последовательности. Умеренно повторяющиеся некодирующие последовательности (НП) в геноме эукариот представлены генными семействами и мобильными генетическими элементами (транспозонами). Известно, что нативные транспозоны содержат конкретные гены, способные обеспечивать их сохранение в геноме. Деление умеренно повторяющихся НП на две вышеупомянутые группы довольно условно в связи с тем, что их функциональная значимость для эукариотического генома не достаточно изучена.

Мобильные генетические элементы представляющие собой НП ДНК, способные изменять свою локализацию в геноме, то есть совершать акты транспозиции. Хотя официально признанная классификация транспозонов в настоящее время отсутствует, на основании молекулярных механизмов, используемых мобильными генетическими элементами для перемещения в геноме, их разделяют на ретроэлементы и ДНК-транспозоны.

ДНК-транспозоны типичны для генома бактерий и достаточно широко представлены в геномах эукариот. Их транспозиция осуществляется, как правило, по механизму вырезания и вставки с участием транспозазы - хорошо изученного фермента класса рекомбиназ. При этом новое место интеграции мобильного элемента, как правило, находится недалеко от старого, и, в соответствии с этим, процесс перемещения ДНК-транспозонов получил название «локальных прыжков» [Патрушев, 2007].

Ретроэлементы, в отличие от ДНК-транспозонов, используют для своей мобилизации механизмы, в которых важную роль играет обратная транскрипция - синтез ДНК на матрице РНК обратной транскриптазой. Следует подчеркнуть, что в результате каждого акта транспозиции ретроэлемента его исходная НП остается в геноме на старом месте, а соответствующая копия появляется в новом генетическом локусе. Таким образом, количество копий транспозона в геноме удваивается. Это является одним из мощных механизмов увеличения размера эукариотического генома, что имеет особо важное отношение к основной обсуждаемой проблеме.

Уникальные последовательности. Содержание уникальных последовательностей в геноме, определенное на основании кинетики реассоциации фрагментированной ДНК, варьирует у разных организмов, и их доля составляет 15-98% от всей ДНК. Несмотря на то, что во фракцию уникальных последовательностей попадают многие структурные гены, большая часть уникальных последовательностей является некодирующей и обычно не заключает в себе генетической информации в общепринятом значении этого термина: не кодирует функционально значимые полипептидные цепи или РНК [Патрушев, 2007].

Хорошо известным примером уникальных нуклеотидных последовательностей (НП) являются интроны, общий размер которых, как правило, превышает суммарный размер экзонов соответствующих генов. Интроном называют транскрибируемый участок гена, последовательность которого отсутствует в зрелой РНК и удаляется из предшественника РНК разными механизмами. Зрелая РНК составлена последовательностями экзонов гена. Мозаичная экзон-интронная структура генов обнаружена у представителей большинства таксономических групп современных биологических видов. Интроны присутствуют в ядерных генах, кодирующих мРНК, рРНК (правда, пока они обнаружены только в генах высокомолекулярных рРНК низших эукариот) и отдельные типы тРНК.

Прерывистые гены часто встречаются в генах хлоропластов и митохондрий, которые кодируют информационные, рибосомные и транспортные РНК этих органелл. В то же время среди генов млекопитающих, которые почти всегда содержат интроны, встречаются исключения. Так, в большинстве генов, кодирующих пять гистонов, интроны отсутствуют; это же относится и к генам двух семейств, кодирующим ?- и Р-интерфероны. Напротив, единственный ген 7-интерферона содержит множество интронов. Не обнаружены интроны в генах 5,8S- и 5S-pPHK, а также ни в одном из генов U-PHK, 7SL-PHK и 7SK-PHK.

Мутационный процесс и молекулярные основы эволюции.

В зависимости от причин, вызывающих мутации, их принято разделять на спонтанные и индуцированные. Спонтанные мутации возникают самопроизвольно на протяжении жизни организма в нормальных для него условиях существования. Индуцированные же мутации появляются в результате тех или иных мутагенных воздействий окружающей геном среды или в экспериментальных условиях под действием различных мутагенных факторов [Maki, 2002].

Эндогенный мутагенез, обусловленный внутренними причинами, лежит в основе возникновения спонтанных мутаций. В результате повреждения ДНК или включения в ее цепь неправильного нуклеотида возникает премутация, которая по завершении репликации превращается в мутацию, если система репарации не справляется с возникшей проблемой. При этом количество возникающих в геноме мутаций прямо пропорционально количеству предшествующих премутаций, т.е. в конечном счете количеству возникающих повреждений ДНК [Maki, 2002].

Выявлены три основных причины спонтанного возникновения премутаций. Во-первых, молекулы ДНК in vivo характеризуются химической нестабильностью. При нейтральных значениях pH и нормальной температуре происходит гидролитическая депуринизация цепей ДНК с образованием апуриновых (AP-) сайтов и последующим разрывом фосфодиэфирных связей, дезаминирование остатков С и 5-mC с образованием U и T, соответственно и т.п.

В качестве второй причины необходимо отметить ошибки синтеза ДНК in vivo. При репликации хромосомной ДНК происходит ошибочное включение нуклеотидов, некомплементарных матричной цепи ДНК с частотой 10-7-10-8. Кроме того, во время репликации иногда имеет место проскальзывание 3?- конца растущей цепи ДНК вдоль матрицы, что может приводить к мутациям со сдвигом рамок считывания. Наконец, способность к перемене матрицы ДНК-полимеразой во время синтеза ДНК, то есть к переходу молекулы ДНК- полимеразы с одной матричной ДНК на другую без терминации синтеза ДНК, открывает путь к одновременной замене большого числа нуклеотидов [Maki, 2002].

В-третьих, в процессе нормальной жизнедеятельности эукариотических клеток образуются многочисленные эндогенные мутагены, которые после взаимодействия с ДНК повреждают нуклеотиды, что в ряде случаев может изменить ее кодирующий потенциал. Еще более часто возникают аддукты эндогенных мутагенов с нуклеотидами-предшественниками ДНК внутриклеточного пула, которые могут включаться в ДНК и изменять ее структуру [Патрушев, 2007].

В условиях нормальной жизнедеятельности организма эндогенные химические мутагены вносят основной вклад в спонтанный мутагенез. Во многих биохимических реакциях в качестве промежуточных и побочных продуктов образуются реакционно-способные метаболиты, способные взаимодействовать с ДНК. В частности, в реакциях окисления-восстановления субстратов с участием кислорода постоянно образуются свободные радикалы, которые повреждают молекулы геномной ДНК . Действие свободных радикалов на ДНК является одной из причин возникновения многочисленных модифицированных азотистых оснований, удаление которых ДНК- гликозилазами приводит к образованию апуриновых (AP) сайтов и, как следствие, одно- и двухцепочечных разрывов ДНК. Обычно, в отсутствие репарации, AP-сайты приводят к заменам нуклеотидов (AP-сайт > T), а также могут быть источником мутаций со сдвигом рамки считывания и других мутаций [Патрушев, 2007].

Существенный вклад в эндогенный мутагенез вносят эндогенные алкилирующие агенты: S-аденозилметионин (SAM), бетаин и холин. Так, предполагается, что SAM в течение суток может генерировать в каждой клетке животных образование ~4000 молекул 7-метилгуанина, 600 молекул 3- метиладенина и 10-30 молекул O6-метилгуанина. Большое число эндогенных повреждений ДНК, в том числе и AP-сайты, образующиеся под действием ДНК-гликозилаз, блокируют перемещение репликативной вилки вдоль ДНК. В этом случае синтез ДНК через поврежденный участок осуществляют специализированные ДНК-полимеразы, которые включают в строящуюся цепь ДНК некомплементарные матрице нуклеотиды с образованием премутаций [Патрушев, 2007].

Еще одним эндогенным фактором, который может вносить заметный вклад в эндогенный мутагенез у эукариотических организмов, являются мобильные генетические элементы. Образованием мутаций завершается инсерционный мутагенез, связанный с мобилизацией транспозонов, после их транспозиции в кодирующие участки генома. Так, до 10% всех спонтанных мутаций у мышей вызвано инсерциями ретроэлементов [Патрушев, 2007].

Кроме вышеперечисленных эндогенных биохимических факторов постоянными источниками мутагенов и их предшественников являются экологическая обстановка, а также жизненные привычки организмов, включая особенности питания. В частности, электромагнитное ионизирующее излучение является одной из причин образования свободных радикалов в организме, которые повреждают нуклеотиды ДНК.

Индуцированные мутации возникают под действием мутагенов; образовавшиеся клетки называют индуцированными мутантами. Мутагенами могут быть химические агенты (нитриты, алкилируюшие агенты, акридиновые красители, этиленимин, азотистый или серный иприт и т.д.), физические (ультрафиолетовые лучи - 260 нм, ионизирующее излучение) или биологические (бактериофаги). Под действием мутагена частота мутаций увеличивается и составляет 1/105-1/103.

Молекулярно-генетический полиморфизм в популяциях.

Согласно синтетической теории эволюции, элементарное эволюционное явление начинается с изменения генетического состава (генетической конституции, или генофонда) популяции. К процессам, способствующим преодолению генетической инертности популяций и приводящим к изменению их генофондов, относят мутационный процесс, популяционные волны, изоляцию, естественный отбор. По этой же причине, популяции, обитающие в контрастных условиях, будут различаться между собой на молекулярном уровне, даже если они будут незначительно удалены друг от друга [Цветков, 2011; 2013; Дроганов, 2014].

Под термином «молекулярный полиморфизм» понимают совокупность индивидуальных особенностей первичной структуры геномной ДНК, накопленная в результате мутаций и рекомбинации. Практически сразу после выявления молекулярного полиморфизма отдельных особей животных, его стали рассматривать как признак, по которому можно производить идентификацию видов, внутривидовых групп и характеризовать крупные таксоны, таких как род и семейство [Цветков, 2011; 2013; Дроганов, 2014].

Наиболее распространенными маркерами молекулярного полиморфизма долгое время являлись случайно амплифицированные с помощью ПЦР фрагменты ДНК (англ. RAPD - random amplified polymorphic DNA). Достоинством этого типа молекулярных маркеров является то, что их можно получить, не имея никакой информации о первичной структуре исследуемой ДНК, тем более что в 80-х годах прошлого века, когда RAPD стал использоваться для молекулярной дифференциации родственных генотипов, такой информации было чрезвычайно мало. Ее и сейчас не всегда достаточно, например, для молекулярной систематики и филогении редких и малоизученных видов животных, поэтому технология RAPD применяется до сих пор. Однако сложности, связанные со стандартизацией процедуры RAPD и ее воспроизведением, постепенно уводят RAPD-маркеры на второй план. И естественно, что на первый выходят другие, основанные на определенных знаниях о последовательности ДНК-маркеров, к которым относятся полиморфизм межмикросателлитных последовательностей ДНК (англ. ISSR inter-simple sequence repeat), полиморфизм рестрикционных фрагментов (ПДРФ, англ. RFLP - restriction fragment length polymorphism) и секвенирование определенных последовательностей ДНК, чаще всего полиморфных генов и их гомологов [Цветков, 2013].

Прикладной аспект работ, произведенных с использованием молекулярных дифференциаторов, трудно переоценить. Прежде всего, это фундаментальные достижения, позволившие выстроить строгую филогению и систематику трудноопределяемых видов, в частности, 13 видов Харациновых рыб рода Prochilodus, несколько видов рыбы-иглы рода Potamorrhaphus, 91 вид цихлид, 3 вида гольцов (род Salvelinus) и мальмы (Тихоокеанский подвид гольца) Дальнего Востока, разных видов форели, например, идентификация микижи Oncorhynchus mykiss Walbaum и дифференциация ее от других видов радужной форели, а также ее северной и южной форм, систематизация сигов акватории Белого моря и многих других видов и подвидов. Следует отметить, что в настоящее время статьи по систематике и филогении практически всегда сопровождаются молекулярно-генетическим анализом исследуемых видов. Более того, вводится и постепенно получает распространение понятие ДНК- штрихкодирование - метод идентификации генотипа по стандартной последовательности ДНК. Для животных в качестве такого стандарта предложено использовать вариабельную 5?-последовательность митохондриального гена co1, для растений и грибов такая последовательность пока не выбрана (цит. по [Цветков, 2013]).

Вместе с накоплением данных о генетическом разнообразии постоянно совершенствуются и становятся все более доступны методики молекулярно- генетического анализа, нацеленные на меж- и внутривидовую дифференциацию, широко применяется секвенирование, которому подвергают все более протяженные последовательности ДНК, в итоге разрешающая способность и информативность анализа резко повышается. С помощью этого метода по первичной структуре гена цитохрома b - cyb, например, удалось идентифицировать 154 вида цихлид (всего семейство насчитывает в среднем по разным источникам до 600 видов рыб), и не только идентифицировать, но и проанализировать их филогению и географию распространения.

Постепенно становятся популярными дифференциаторами последовательности мобильных элементов или транспозонов, также привносящие большое разнообразие в совокупность близкородственных генотипов благодаря случайному характеру инсерции/делеции. В частности, охарактеризованы мобильные элементы Tsp и TU морского ежа Strongylocentrotus purpuratus Stimpson, с их помощью оценено генетическое разнообразие вида, однако достаточной информации для массового использования транспозонов в геносистематике животных пока явно недостаточно.

Хорошо изучены транспозоны у свободноживущей нематоды Caenorhabditis elegans Maupas - излюбленного объекта исследования в молекулярной биологии. Обнаруженные у этого вида транспозоны, Tc1, Tc2, Tc3, Tc5 можно пытаться использовать для работы и с другими более совершенными видами, учитывая, что в эволюционном плане все они происходят от круглых червей. Конечно, в процессе эволюции последовательности транспозонов могли существенно измениться и это сильно осложняет их локализацию, однако, некоторые успехи уже имеются, например, обнаружение нами гомологов Tc1 у моллюска живородка речная (Viviparus viviparus L.) и анализ внутривидового полиморфизма в природных популяциях живородки [Цветков, 2013; Дроганов, 2014].

Наконец последнее, что следует отметить в контексте работ по геносистематике - все более популярные в литературе тенденции использования молекулярно-генетического маркирования для выявления связей с условиями обитания животных, особенностями их экологии и процессом формирования природных популяций. В частности, были проанализированы популяции тропической рыбки брикон Хилари (Brycon hilary Cope), выявлена определенная корелляция между схожестью и различием местобитания и степенью родства популяций брикона, но поскольку в работе был использован несовершенный метод RAPD, авторы сомневаются в обоснованности сделанных ими выводов. Более детально исследованы популяции земляного червя Eudrilus eugeniae Kinberg, обитающего в Индии, на территориях в разной степени загрязненных промышленными и бытовыми отходами. Для молекулярного анализа использованы методы RAPD и ISSR, полученные данные позволили дифференцировать 24 популяции червя, проведен кластерный анализ и показано, что в зонах промышленного загрязнения полиморфизм популяций червя значительно выше, а степень родства с другими популяциями достоверно ниже. Это может свидетельствовать о процессе видообразования, прогрессирующем в измененных экологических условиях и, возможно, ведущим к формированию нового вида. Подобных исследований, проведенных на водных животных, в литературе практически не встречается.

Индивидуальная изменчивость и межпопуляционный полиморфизм как факторы генетической адаптации к условиям обитания.

Нетранскрибируемые последовательности ядерной ДНК эукариот довольно давно находятся в центре внимания молекулярных генетиков. Изменчивость в этой области ДНК не отражается на фенотипе и беспрепятственно накапливается в популяциях, благодаря чему даже у отдельных особей формируется уникальная первичная структура генома. Исследование сходства и различий уникальных последовательностей, производимое методами кластерного анализа, позволяет охарактеризовать филогенетические связи между группами особей практически любого уровня, главное, чтобы эти группы имели какие-либо естественные границы своего распространения, как, например, непреодолимые препятствия или расстояния, различия в сроках или способах размножения и т.д.

Однако, возможна и другая трактовка результатов, которые получаются из анализа первичной структуры ДНК. Заключается она в исследовании корреляции молекулярно-генетического полиморфизма с особенностями условий обитания. Мутационный процесс, ошибки репликации, рекомбинация и как следствие, формирование индивидуальной первичной структуры ДНК происходят в любых условиях обитания, но в состоянии стресса при усилении техногенной нагрузки становятся более вероятными. Причин тому может быть несколько, это непосредственное влияние некоторых токсикантов (мутагены) или физических факторов (ультрафиолетовое или радиационное излучение) на структуру ДНК, а также действие, оказываемое опосредованно через нарушение синтеза, своевременной репарации, и, наконец, регуляторные процессы адаптивного значения. Следовательно, в неблагоприятных условиях обитания техногенный мутационный процесс должен преобладать над естественным. В соответствии с этим, индивидуальная изменчивость и молекулярно-генетический полиморфизм должны быть выше в тех популяциях, которые испытывают большую техногенную нагрузку, и ниже, где условия существования близки к оптимальным.

Наиболее перспективными в этом отношении считаются молекулярно- генетических дифференциаторов (полиморфизм межмикросателлитных и межтранспозонных фрагментов геномной ДНК, полученных с помощью ПЦР) приводит к формированию кластеров, соответствующих станциям сбора материала. Полиморфизм внутри популяций также имеет место, однако, его значительно превосходят межпопуляционные различия.

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Особенности биологии исследованных животных

Для исследования были использованы пресноводные моллюски, принадлежащие к классу Gastropoda - прудовик обыкновенный (Lymnaea stagnalis L.), прудовик ушковый (Lymnaea auricularia L.), живородка речная (Viviparus viviparus L.), беззубка обыкновенная (Anodonta cygnea L.), перловица обыкновенная (Unio piktorum L.). В ходе последующего выбора наиболее удобного объекта исследования мы остановились на речной живородке. На биологии и систематических признаках этого вида моллюсков остановимся подробнее.

Живородка речная - вид пресноводных моллюсков, принадлежащих к классу Gastropoda, семейству Viviparidae. Моллюски имеют крупную (высотой до 40-45 мм) толстостенную кубаревидную раковину красно- коричневого или серо-зеленоватого цвета с уплощенными оборотами и закрытым пупком. Обороты закруглены и разделены друг от друга отчётливым швом. Молодые особи имеют почти шаровидную раковину с тремя спиральными рядами щетинок. Устье раковины закрывается концентрической необызвествленной крышечкой.

Обитает живородка речная в реках и озерах с чистой водой в зоне зарослей, реже на открытом грунте. Держится на дне или прикрепляется к камням или корягам, также может зарываться в грунт и проводить там достаточно долгое время.

2.2 Сбор биологического материала

Моллюсков собирали с помощью гидробиологического сачка и вручную с поверхности водной растительности и дна прибрежной зоны водоема. На каждой станции собирали по 6 особей одного вида моллюсков.

Собранных гидробионтов помещали в пакеты, наклеивали этикетки, наполняли водой из водоема и транспортировали в лабораторию, где препарировали методом вивисекции. Для дальнейшего эксперимента использовали мышечную ткань каждого моллюска.

2.3 Сбор образцов грунта

Для отбора проб грунта использовали дночерпатель Петерсона 1/64 м2 (захватывает площадь 125?125 мм2), который отвесно бросали от поверхности воды. Под своим весом он зарывался в грунт, при подъеме дночерпатель захлапывался. Пробу грунта извлекали из дночерпателя и целиком переносили в полиэтиленовые пакеты, в которых транспортировали в лабораторию, где высушивали при комнатной температуре, растирали в ступке, просеивали через мелкое сито и упаковывали в стеклянные банки с навинчивающимися герметичными крышками. Каждая проба содержала 50-100 г грунта воздушной сухости и снабжалась этикеткой. В течение 2-5 дней пробы доставлялись в химическую лабораторию ООО «Биотест», г. Москва, сотрудники которой по нашему заказу определяли в них содержание тяжелых металлов методом атомной абсорбции [ГОСТ Р 53218-2008], полихлорированных бифенилов (ПХБ) [ГОСТ Р 54503-2011] и нефтепродуктов методом газовой хроматографии [ГОСТ Р 52406-2005].

2.4 Выделение ДНК

ДНК выделяли из мышечной ткани моллюсков методом, предложенным Boom с соавторами, при помощи готового набора для выделения нуклеиновых кислот «Silica uni» («Биоком»). В пробирку объемом 1,5 мл помещали 100 мг мышечной ткани и прибавляли 600 мкл лизирующего раствора с содержанием сильного хаотропного агента - гуанидина тиоцианата (GuSCN), затем образец измельчали с помощью гомогенизатора до полного диспергирования. После этого пробирку встряхивали и центрифугировали в течение минуты при 10000 об/мин. Супернатант переносили в чистую пробирку на 1,5 мл и добавляли 20 мкл сорбента (диатомовая земля), после чего пробирку энергично встряхивали в течение 5 минут, затем центрифугировали при 10000 об/мин. После этого супернатант отбрасывали, а к осадку добавляли 300 мкл солевого буфера, энергично встряхивали и центрифугировали при 5000 об/мин. Данную операцию повторяли 3 раза, полностью отбирали супернатант и отбрасывали, осадок сушили при 65°С в течение 5 минут. Затем прибавляли 100 мкл элюирующего буфера, термостатировали и периодически встряхивали в течение 5 минут. После этого содержимое пробирки центрифугировали 1 мин. при 10000 об/мин. Супернатант полностью отбирали и хранили при -20°С.

2.5 Постановка ПЦР

Для проведения реакции амплификации готовили реакционную смесь. В пробирку PCR-core, содержащую сухую смесь 0,25 мМ каждого дНТФ, 1 ед. Taq ДНК-полимеразы и стабилизаторов, добавляли 10 мкл растворителя (1% трис-HCl буфер, рН 9,4, 2,5 мМ MgCl2, 0,05% Tween 20) дожидались полно растворения сухого содержимого, затем добавляли 5 мкл раствора праймеров (2 мкМ) и 5 мкл испытуемого образца, содержащего 10-50 нг ДНК от индивидуальной особи. Полученную смесь перемешивали и «закрывали» каплей минерального масла, предотвращающего испарение при нагревании. В качестве отрицательного контроля готовили пробирку с аналогичной смесью, куда вместо ДНК добавляли стерильную деионизованную воду [Коничев, 2012].

Пробирки переносили в амплификатор «Терцик», в котором была выполнялась следующая программа (температурный режим) амплификации:

1. Начальная денатурации (4 мин 94°С);

2. 35 циклов, включающих:

Денатурация (40 сек 94°С),

Отжиг праймеров (40 сек Х°С),

Элонгация (30 сек 72°С);

3. Заключительная элонгация (3 мин 72°С);

4. Хранение (4°С).

Х = 45-60°С в соответствии с оптимальной для используемого праймера.

2.6 Проведение электрофореза

Для визуализации результатов амплификации использовали метод электрофореза, основанный на разделении молекул ДНК по размеру. Для этого готовили пластину агарозного геля, представляющего собой застывшую после расплавления в электрофорезном трис-боратном буфере агарозу в концентрации 1,5% с добавлением бромистого этидия -флуоресцентного красителя ДНК. Расплавленную агарозу заливали на специальный столик и с помощью гребенок в геле формировали лунки, в которые в дальнейшем вносили продукты амплификации. Пластину геля помещали в камеру для горизонтального гель-электрофореза, которую подключают к источнику постоянного напряжения. Электрофорез проводили 40 мин при 120 В. Затем гель помещали на фильтр трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне (254-310 нм) и фотографировали с помощью гель-документирующей видеосистемы. Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 нм).

Полиморфные фрагменты идентифицировали по молекулярной массе, которую определяли с помощью маркера молекулярной массы Gene Ruler 100 bp+ DNA Ladder (Fermentas, Литва) [Коничев, 2012].

2.7 Статистическая обработка полученных результатов

В настоящем исследовании для статистической обработки полученных данных использовали программу STATISTICA 10.0 (Stat Soft Inc., США) для Windows 7 (?64). Предварительным этапом обработки данных является построение матриц. Матрицы составляли для данных о загрязненности грунта водоемов и полиморфных ПЦР-фрагментов ДНК речной живородки.

Матрица данных о содержании загрязнений в пробах грунта представляла собой таблицу, в которую сведены все полученные значения для всех проанализированных показателей (номера станций - по горизонтали, показатели - по вертикали). Матрица данных о наличии/отсутствии определенных олигонуклеотидных фрагментов на электрофреграммах у особей из различных популяций живородки речной представляла собой аналогичную таблицу, но составляли её на основе анализа электрофореграмм. Для этого каждый ПЦР-фрагмент ДНК на электрофореграмме идентифицировали по размеру с помощью маркера Gene Ruler 100 bp+ DNA Ladder, после чего его наличие или отсутствие на электрофореграмме каждой особи живородки отмечали в таблице цифрами «1» и «0» соответственно (рис. 1)

Рис. 1. Электрофореграмма ПЦР-продуктов амплификации ДНК речной живородки. М - маркер молекулярной массы Gene Ruler 100 bp+ DNA Ladder (500, 1000, 2000 - длина фрагментов маркера, п.н.); 7.7, 1.3 группы особей с соответствующих станций сбора (для примера); «1» - наличие фрагмента; «2» - отсутствие фрагмента

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1 Выбор объекта исследования

В качестве объекта исследования были выбраны животные, постоянно обитающие в воде - пресноводные моллюски. Одной из причин такого выбора является то, что все они испытывают наиболее тесный контакт с окружающей средой по сравнению с другими экологическими группами животных. Пресноводные гидробионты постоянно испытывают техногенную нагрузку вследствие попадания токсических веществ в воду из воздуха, с поверхности почвы и в ходе прямого загрязнения водной среды. По причине своей малоподвижности пресноводные моллюски не могут достаточно быстро переместиться в более благоприятные места обитания и поэтому они вынуждены адаптироваться к изменившимся условиям, вырабатывая определенные механизмы биохимической адаптации к токсическому воздействию.

Именно гидробионты являются удобным объектом для изучения механизмов адаптации, выявления границ индивидуальной изменчивости, что позволяет делать выводы о степени устойчивости и чувствительности к техногенному фактору.

Для исследования были отобраны наиболее часто встречающиеся и простые для определения до вида моллюски: живородка речная (Viviparus viviparus), прудовик обыкновенный (Lymnaea stagnalis), прудовик ушковый (Lymnaea auricularia). Данные виды моллюсков широко распространены в водоемах Московской области и являются удобными объектами для сбора и временного содержания в лабораторном микрокосме.

3.2 Оптимизация условий ПЦР

Одним из наиболее важных составляющих анализа молекулярного полиморфизма фрагментов ДНК является подбор олигонуклеотидных праймеров и оптимизация условий ПЦР (полимеразная цепная реакция). При подборе праймеров опирались на известные исследования по выявлению внутривидового полиморфизма у хорошо изученных видов моллюсков, генетически родственных исследуемому нами виду, таких, например, как Helix aspersa, Biomphalaria glabrata, а также других видов беспозвоночных животных - представителей круглых червей, являющихся генеалогическими предками моллюсков, таких, например, как Caenorhabditis elegans и Schistosoma mansoni. В ходе исследования исследования был протестирован 21 праймер (табл. 1). Наиболее удачные из них отбирали по результатам экспериментов.

Таблица 1. Характеристики олигонуклеотидных праймеров для амплификации полиморфных фрагментов ДНК V.viviparus

Примечания

*Праймеры, в названиях которых присутствуют обозначения F (forward, прямой) и R (reverse, обратный), использованы попарно; при отсутствии таких обозначений соответствующий праймер служил прямым и обратным одновременно.

**В скобках приведены ссылки на следующие литературные источники: 1 - [Antunes, 2010], 2 - [Guiller, 2000], 3 - [Martin, 2002], 4 - [Raghavana, 2007]; прочерк - данные не опубликованы

Температуру плавления каждого праймера для ПЦР определяли, руководствуясь следующими эмпирическими формулами:

1) Tm°C = [(A+T) ? 2] + (G+C) ? 4] (если суммарная длина олигонуклеотида не превышает 20 оснований);

2) Tm = 22 + 1.46 ? ([2 x (G+C)] + (A+T)) (если суммарная длина олигонуклеотида составляет 20-30 оснований).

В том случае, если продукты ПЦР с конкретным праймером на электрофореграмме были нечеткими, либо были представлены в небольшом количестве, или же присутствовали неспецифические продукты ПЦР, то температуру отжига корректировали до достижения наибольшей четкости и максимального числа специфических фрагментов ПЦР (рис.2).

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов ПЦР-амплификации ДНК речной живородки: 1 - маркер молекулярной массы (200, 500, 1000 - размер фрагментов маркера, п.н.), 2-5 - праймеры Hita2-F&R; 6-9 - TCRS; 10-13 - TCR2; 14 - AACC; 5 - BGR2; 16 - Ha11-F&R

ДНК, выделенная из мышечной ткани каждой особи каждого вида, была использована для постановки ПЦР с каждым из отобранных нами праймеров. Наиболее четкие результаты были получены для вида живородка речная (V. viviparus). ДНК, выделенная из мышечной ткани живородки, могла храниться в замороженном виде в течение продолжительного периода. Продукты ПЦР на электрофореграммах были наиболее четкими, представлены большим количеством фрагментов (более 20), что делало их удобными для статистической обработки. Результаты эксперимента хорошо воспроизводились на разных наборах для постановки ПЦР-реакции.

Из всей совокупности отобранных праймеров, наиболее удачными для амплификации полиморфных фрагментов ДНК живородки оказались ААСС, АТГГ, Ha2-F&R, Ha5, Ha11, Ha11-F&R, Hita2, Hita5-F&R, ТС5.4, TC1R1S, ТСЗ.1, TC1R2, BGR2-F&R. На электрофореграммах с каждого из них наблюдались отчетливо различимые продукты ПЦР, представленные в большом количестве и были удобными для последующей обработки. Именно эти праймеры были использованы на следующих этапах исследования.

Остальные праймеры не подошли для исследования, поскольку продукты ПЦР электрофореграммах не были обнаружены или же были сложно различимы и представлены в небольшом количестве, что затрудняло их дальнейшую обработку. Кроме того, продукты ПЦР с данными праймерами не всегда воспроизводились должным образом, и для дальнейшего ПЦР-анализа мы их не использовали.

Для остальных видов моллюсков результаты оказались неоднозначными. На электрофореграммах продукты ПЦР были нечеткими, представлены в небольшом количестве (менее 5 фрагментов), зачастую плохо разделялись между собой или не всегда воспроизводились в одних и тех же условиях. В итоге статистическая обработка таких результатов оказалась затруднительна, и от использования этих видов моллюсков в качестве объектов исследования было решено отказаться.

3.3 Выбор и характеристика водоемов

Для исследования были выбраны водоемы, расположенные на территории Москвы и Московской области: водохранилища Пестовское, Пироговское, Химкинское, Клязьминское и река Москва в верхнем течении относительно территории г. Москвы. По берегам каждого из этих водоемов было выбрано несколько станций сбора гидробионтов (табл. 2).

Таблица 2. Расположение станций сбора материала

*Примечание: в обозначениях станций сохранены оригинальные номера, присвоенные в ходе значительно более масштабного исследования, только часть результатов которого получена при участии автора и стала предметом обсуждения в настоящей работе

При выборе станций учитывались следующие особенности:

1) доступность (наличие подходов, подъездов, свободный допуск),

2) наличие в водоеме исследуемых видов моллюсков,

3) ожидаемый уровень загрязненности вследствие близости техногенных объектов (населенных пунктов, промзон, крупных автомагистралей, сельскохозяйственных угодий), территориальная разобщенность водоемов, исключающая свободное распространение моллюсков,

На данном этапе работы был проведен сбор информации о районах, где расположены исследуемые водоемы. Далее была изучена прибрежная зона водоемов, дна и непосредственно толщи воды, взяты пробы грунта для приготовления вытяжек и анализа химического состава и количества основных загрязнителей водоемов, а именно полихлорированных бифенилов (ПХБ), Cu2+, Zn2+, Pb2+, Ni2+, Cr3+, Cd2+, нефтепродуктов. Анализ был произведен в химической лаборатории ООО «Биотест», Москва (табл. 3).

Таблица 3. Содержание основных загрязнителей в грунте исследованных водоемов*

Примечания

*Доверительные интервалы для всех значений чрезвычайно малы и составляют 2-4%

Поскольку проанализированные загрязнители склонны к аккумуляции и определялись в донных отложениях, их содержание в вытяжках из грунта существенно превышает их концентрацию в воде и указанные значения ПДКводн. Величина ПДКводн. в данном случае приведена только для ориентира и сравнительной оценки токсичности разных веществ.

Химический анализ воды в местах сбора моллюсков не проводился, так как является сезонным показателем, зависящим от многих факторов - осадков, силы течения, растворимости веществ, взаимного влияния их друг на друга, поведения в водном растворе, температуры воды, освещенности, деятельности живых организмов, населяющих водоемы.

Станции 1.1-1.3 расположены в малонаселенной местности на берегу Пестовского водохранилища, образованного посредством строительства гидроузла на реке Вязь. Водохранилище судоходно. Используется для водоснабжения Москвы. Его юго-западная часть соединяется с Икшинским водохранилищем, северная часть - с Пяловским водохранилищем, а северо- западная часть - через Пестовскую плотину с Учинским водохранилищем. На водохранилище располагаются пристани «Хвойный Бор», «Зелёный Мыс»,

«Лесное», «Михалёво» и «Тишково». Является популярным местом отдыха.

Берега водоема сильно заросли водной и прибрежноводной растительностью; преобладают рогоз, осоки, рдест, роголистник, кувшинка. Среди беспозвоночных в изобилии встречены личинки вислокрылок, подёнок, веснянок, моллюски - живородка, прудовик, перловица, беззубка, множество пиявок, бокоплавов, водяных осликов, попадаются мелкие раки. Вблизи берега держится множество мальков плотвы. Цветение воды отсутствует. На дне мало детрита, автотрофных организмов и бентосных животных (малощетинковых червей, личинок комаров-долгоножек). В целом гидробиологическое состояние водоема благоприятное, явных признаков загрязнения воды, замусоривания берегов не выявлено.

ПХБ, Zn2+, Cd2+ на станции обнаружено не было, содержание катионов меди колеблется в пределах ПДК, содержание Pb2+, Ni2+, Cr3+ превышает величину ПДК незначительно, тогда как нефтепродукты превышают значение ПДК в 10 раз.

Станции 8.1, 8.2 и 8.4 расположены на берегу Пироговского водохранилища вдали от автомагистралей, промышленных и населенных районов. Водохранилище является частью Клязьминского водохранилища от Чиверево до Пироговской плотины, судоходно. На берегу водохранилища находится популярное место отдыха «Бухта радости» с одноимённым причалом. Соединено с Пяловским и Химкинским водохранилищами искусственным каналом им. Москвы. На восточном окончании построена плотина, сквозь которую вытекает река Клязьма. Водохранилище популярно среди яхтсменов и любителей гидроцикла [Чухрай, 1969]

Берега водоема и прибрежная зона сильно заросли растительностью, из высших растений преобладают рогоз, осоки, рдест, роголистник. Глубина прибрежной зоны увеличивается постепенно. Явных признаков загрязнения и замусоривания не отмечено. Вода прозрачная, дно в основном песчаное, иногда встречаются заиленные участки; детрит содержит остатки растительного и животного происхождения. Вода стоячая, практически отсутствует течение. В водоеме обнаружено много червей, моллюсков, личинок подёнок, вислокрылок, стрекоз, комаров-долгоножек, мошек. Встречаются ракообразные и рыбы. Среди моллюсков были встречены живородка, прудовик обыкновенный, прудовик ушковый. Общее состояние водоема весьма благоприятное.

ПХБ и Cd2+ на станции не обнаружены, а остальные токсиканты, находятся в количествах, превышающих значение ПДК в 3-5 раз.

Станция 9.1 расположена на берегу Клязьминского водохранилища вблизи от автомагистралей, промышленных и населенных районов. Водоем является судоходным. На берегах водохранилища располагаются зоны отдыха с гостиницами, ресторанами, кафе для детей, мини-зоопарком. Распространён яхтенный и парусный спорт. По берегам расположено множество лодочных станций, с вёсельными и моторными лодками, катамаранами, катерами и водными мотоциклами, большое количество пляжей и причалов. Берега водоёма заселены, левый берег местами распахан [Нарочницкий, 1980]. Вполне вероятны загрязнения металлической пылью и топливом, отходами с предприятий, а также бытовыми отходами.

Берега не имеют обильной растительности. Водная растительность также встречается редко. Течение практически отсутствует. Глубина водоема быстро нарастает. Дно в прибрежной зоне песчаное; детрит, содержащий остатки растительного и животного происхождения, встречается на небольшом удалении от берега.

Ил серого цвета и в нем содержатся организмы, приспособленные к недостатку кислорода и высокому содержанию углекислоты, также имеются включения растительного и животного происхождения (в основном раковины брюхоногих моллюсков). Среди гидробионтов преобладают тубифициды, личинки ручейников, стрекоз, пиявки, а также моллюски вида живородка речная и мелкие двухстворчатые моллюски. В водохранилище водятся плотва и подлещик.

Все исследованные токсиканты за исключением Cd2+ значительно превышают ПДК; содержание Cd2+ в пределах нормы. В целом состояние водоема можно оценить, как неудовлетворительное.

Станции 10.1-10.4 находятся на берегу Химкинского водохранилища вблизи от автомагистралей и населенных районов - водохранилище расположено на северо-западе Москвы на границе районов Южное Тушино, Северное Тушино, Покровское-Стрешнево, Войковский, Головинский, Левобережный и подмосковного города Химки. Над поверхностью водохранилища построены три автомагистрали и железнодорожный мост. Водоем является судоходным. На водохранилище расположены Северный речной вокзал, от причалов которого отходят теплоходы, связывающие Москву с пятью морями, и Северный речной порт столицы. Имеются также пассажирские пристани Захарково и Дубовая Роща. Берега водохранилища являются популярным местом отдыха. Близ водохранилища размещены водноспортивные комплексы. На акватории водохранилища традиционно проводятся различные спортивные соревнования [Нарочницкий, 1980].

Берега густо заросли осокой; водная растительность скудна, присутствуют нитчатые зеленые водоросли, на поверхности воды - ряска. Течение практически отсутствует. Глубина водоема медленно нарастает. Дно в прибрежной зоне песчаное. Ил серого цвета, и в нем содержатся организмы, приспособленные к недостатку кислорода и высокому содержанию углекислоты, так же так же имеются включения растительного и животного происхождения (в основном раковины брюхоногих моллюсков).

Среди гидробионтов отмечено много тубифицид, личинки вислокрылок, ручейников, комаров-долгоножек, мошек, водяные ослики, бокоплавы, брюхоногие моллюски. Общее состояние водоема удовлетворительное.

Станции характеризуются значительным превышением уровня ПДК по всем исследованным показателям, что свидетельствует о неудовлетворительном состоянии водоема.

Станции 12.1-12.3 расположены на берегу реки Москвы недалеко от места впадения в нее реки Истры вблизи от автомобильных дорог, дачных поселков и садовых товариществ. Вероятны загрязнения, удобрениями, химическими веществами, используемыми в дачном хозяйстве, а также бытовыми отходами.

Для верхнего течения Москва-реки характерно чередование перекатов с быстрым течением, плёсов с замедленным течением и наличие омутов, где проточность воды почти равна нулю. Глубина водоема быстро нарастает. Река в месте сбора материала около 100 м в ширину, течение медленное, берега густо заросли осокой, водная растительность скудна, присутствуют нитчатые зеленые водоросли, на поверхности воды - ряска. Процессы фотосинтеза угнетены. Грунт песчано-каменистый. В местах сбора моллюсков наблюдается значительная толщина ила (до 50-60 см), поскольку из-за слабого течения происходит интенсивное отложение наносов. Ил серо-черного цвета с запахом H2S, и в нем содержатся организмы, приспособленные к недостатку кислорода и высокому содержанию углекислоты. Вблизи дна преобладают восстановительные процессы; много детрита (слой 20-30 см) темно- коричневого цвета, состоящего из остатков растительного и животного происхождения. Планктон Москва-реки весьма беден, фитопланктон также не отличается высоким разнообразием. Донная фауна верхней части Москва-реки довольно разнообразна, но качественно небогата. Макробеспозвоночные представлены в основном личинками комаров-звонцов, олигохетами Tubifex tubifex, моллюсками живородка речная и мелкими двухстворчатыми моллюсками, встречаются речные раки. Во множестве присутствуют мальки рыб, ловится крупная рыба.

В глубоких омутах и ямах, где течение очень слабое или совсем отсутствует, грунт илистый, обычно встречаются лещ, язь. В прибрежных, сильно заросших растительностью участках, а также в заливах обитают плотва, линь, краснопёрка, серебряный карась.

Все показатели на станции значительно выше предельно допустимых концентраций, что свидетельствует о неблагоприятном состоянии водоема Общее состояние водоема можно охарактеризовать как неудовлетворительное.

3.4 Кластеризация экспериментальных данных

Термин «кластерный анализ» в действительности включает в себя набор различных алгоритмов статистической обработки данных. Общий вопрос, задаваемый исследователями во многих областях, состоит в том, как организовать наблюдаемые данные в наглядные структуры. Существует точка зрения, что в отличие от многих других статистических процедур, методы кластерного анализа используются в большинстве случаев тогда, когда нет каких-либо априорных гипотез относительно классов, но исследование все еще находится в описательной стадии. Большое достоинство кластерного анализа в том, что он позволяет производить разбиение объектов не по одному параметру, а по целому набору признаков. Кроме того, кластерный анализ в отличие от большинства математико-статистических методов не накладывает никаких ограничений на вид рассматриваемых объектов, и позволяет рассматривать множество исходных данных [Hartigan, 1975].

Назначение алгоритма кластеризации состоит в объединении объектов (например, животных) в достаточно большие группы (кластеры), используя некоторую меру сходства или расстояние между объектами (различие).

Типичным результатом такой кластеризации является иерархическое дерево (древовидная диаграмма, дендрограмма), которое описывает близость отдельных точек и кластеров друг к другу и в графическом виде представляет последовательность объединения кластеров. Дендрограмма начинается с каждого объекта в классе (в левой части диаграммы). На данном этапе каждый объект считается отдельным кластером. Постепенно, очень малыми шагами критерий о том, какие объекты являются уникальными, а какие схожими между собой, ослабляется. Другими словами, понижается порог, относящийся к решению об объединении двух или более объектов в один кластер.

В результате, связывается вместе всё большее и большее число объектов и объединяется всё больше и больше кластеров, состоящих из всё сильнее различающихся элементов. Окончательно, на последнем шаге все объекты объединяются вместе. На этих диаграммах вертикальные оси представляют наблюдения, горизонтальные - расстояние объединения. Так, для каждого узла в графе (там, где формируется новый кластер) можно увидеть величину расстояния, для которого соответствующие элементы связываются в новый единственный кластер.

Наиболее общим типом расстояния является Евклидово расстояние. Оно является геометрическим расстоянием в многомерном пространстве. В результате успешного анализа методом объединения появляется возможность обнаружить кластеры (ветви) и интерпретировать их (рис. 3).

Рис. 3. Дендрограмма, построенная при помощи программы Statistica 10.0 по данным молекулярного полиморфизма речной живородки с разных станций сбора

На первом шаге, когда каждый объект представляет собой отдельный кластер, расстояния между этими объектами определяются выбранной мерой. Однако когда связываются вместе несколько объектов, возникает вопрос, как следует определять расстояния между кластерами. Другими словами, необходимо правило объединения или связи для двух кластеров. Для этого применяются различные методы. Мы использовали метод попарной группировки невзвешенных средних (в англоязычной литературе - unweighted pair-group method using arithmetic averages, UPGMA). В этом методе расстояние между двумя различными кластерами вычисляется как среднее расстояние между всеми парами объектов в них. Этот метод наиболее эффективен, когда объекты в действительности формируют различные «рощи» [Sneath, 1973] (в нашем случае - популяции моллюсков или грунты определенным составом загрязнителей) и показал ожидаемые результаты в ходе нашего и предыдущих аналогичных исследованиях, из года в год производимых в лаборатории экологической биохимии МГОУ (сотрудники лаборатории любезно предоставили мне возможность участвовать в исследовании и снабдили данными, недостающими для построения законченной работы, в частности описаниями станций сбора моллюсков, данными химического анализа грунта, итогами оптимизации исследования молекулярного полиморфизма моллюсков методом ПЦР и кластерного анализа биологической информации, за это автор выражает им искреннюю признательность и благодарность).

Кластерный анализ количественных данных о загрязнениях водоемов выявил распределение всех точек сбора по группам. Каждую группу формируют станции, наиболее сходные между собой, как правило, расположенные в одном водоёме (рис. 4).

1.1

1.3

1.2

8.1

8.4

8.2

9.1

10.1

10.2

10.3

10.4

12.1

0 1 2 3 4 5 6

Евклидово расстояние

Рис. 4. Дендрограмма распределения загрязнений по станциям сбора материала. По вертикали - номера станций

Станции 1.1-1.3 были получены при анализе проб грунта, собранных по берегу Пестовского водохранилища. Далее - аналогично: 8.1, 8.2 и-8.4 - Пироговское водохранилище, 9.1 - Клязьминское водохранилище, 10.1-10.4 - Химкинское водохранилище, 12.1-12.3 - р. Москва близ Ильинского шоссе.

Взаиморасположение кластеров на дендрограмме указывает на сходные и различные водоемы, формирующие удобную модельную систему для исследования межпопуляционных различий моллюсков в зависимости от качества среды их обитания.

В результате статистической обработки данных, полученных после ПЦР, была построена дендрограмма, на которой особи распределились по кластерам в соответствии с расположением станций сбора. Все станции сбора, расположенные на одном водоеме, образовали более крупные кластеры. Этот результат полностью соответствует ожиданиям выявить наименьшие различия между группами особей, отобранных из одной популяции (водоема), а также указывает, на то, что изолированные популяции становятся непохожими друг на друга, накапливая всё большие генетические различия (рис. 5).

1.1

1.3

1.2

8.1

8.2

8.4

9.1

12.1

12.2

12.3

10.1

10.2

0 2 4 6 8 10 12 14

Евклидово расстояние

Рис. 5. Дендрограммы распределения полиморфных ПЦР-фрагментов в популяциях V.viviparus по станциям сбора материала. По вертикали - номера станций.

В пределах одного водоема, но на некотором удалении могут возникать популяции, непохожие друг на друга генетически. Причиной этого может служить территориальная изоляция, характерная для столь малоподвижных видов как брюхоногие моллюски, особенно, живородка, которая на всех стадиях индивидуального развития остается привязанной к субстрату.

3.5 Обсуждение результатов

Все водоемы, в которых собирались моллюски, имели различные гидрологические характеристики: показатели сапробности, содержание токсических веществ в грунте, проточность, техногенная нагрузка на водоем. При этом характеристики некоторых из исследованных водоемов оказались очень близки, что в свою очередь повлияло на распределение моллюсков таким образом, что популяции, обитающие в географически разделенных водоемах, оказывались сходны между собой на генетическом уровне.

Состав продуктов ПЦР является молекулярной характеристикой генома. Они без ограничений передаются по вертикали и горизонтали, но поскольку амплифицированные фрагменты в большинстве своем локализованы в нетранскрибируемой части генома, их полиморфизм, скорее всего, никак не проявляется фенотипически, а, следовательно, не подвергается естественному отбору. Однако, поскольку мутации ДНК, индуцированные внешними факторами, могут отразиться на составе продуктов ПЦР, этот признак, помимо естественного процесса накопления спонтанной изменчивости может характеризовать степень воздействия среды обитания на организм, а значит, сказывается и на кластеризации определенных групп особей.

Моллюски со станций 8.# (Пироговское вдхр.) оказались наиболее близки особям со станции 9.1 (Клязминское вдхр.), что в целом соответствует распределению этих станций по уровню загрязненности грунта в указанных водоемах. Более того, данные водоемы географически близки друг другу, будучи связанными в одну аквасистему (рис. 6).

Рис. 6. Карта-схема местности, где расположены Клязьминское и Пироговское водохранилища (по данным Яндекс-карты)

Следующими по степени сходства набора полиморфных фрагментов на дендрограмме расположились моллюски, собранные на станциях 12.# (р. Москва) и 1.# (Пестовское вдхр.), однако, данные водоемы по загрязненности имеют наибольшие различия между собой, а кроме того, территориально эти акватории чрезвычайно разобщены - более 50 км по прямой и отсутствие всякой естественной связи между ними по воде (не считая искусственных каналов с регулируемым стоком и направлением течения в р- не Покровское-Стрешнево, г. Москва). Каковы же могут быть условия обитания, приведшие к генетической близости данных популяций моллюсков, нам выяснить пока не удалось.

Неслучайность выявления этого сходства в обоих случаях подтверждается наибольшей близостью особей, собранных в одном и том же водоеме (кластеры станций 12.1-12.3 и 1.1-1.3 формируются независимо друг от друга, см. рис. 4).

Станции 10.# формируют кластеры, удаленные от остальных на обеих дендрограммах, т.е. особи живородки, обитающей в Химкинское вдхр., генетически отличаются от представителей других популяций данного вида моллюсков так же, как и сам водоем по данным о химическом загрязнении грунта. В то же время, Химкинское вдхр. имеет хоть и удаленную, но непосредственную связь с Клязьминским вдхр. через Канал им. Москвы (чуть более 12 км по воде).

Тем не менее, эта связь практически не сказалась на различии этого водоема от других, выявленном как по химическому составу грунта, так и по набору полиморфных ПЦР-фрагментов речной живородки.

Учитывая, что степень загрязненности играет, пожалуй, решающую роль в кластеризации станций 10.1-10.4, можно предположит, что именно этот фактор повлиял на внутривидовую дифференциацию моллюсков данного водоема вследствие генетической адаптации к условиям обитания.

Таким образом, мы получили данные о молекулярной дифференциации моллюсков, неоднозначно свидетельствующие о причинах этого процесса.

Не исключено, что одним из факторов внутривидовой дифференциации действительно является техногенная загрязненность и экологическое состояние водоемов - мест обитания популяций живородки.

Однако, судя по результатам исследования, это не может служить единственной причиной накопления генетических различий между популяциями (напр., со станций 1.# и 8.#) или сохранения первородного сходства между ними (напр., со станций 8.# и 9.1).

Очевидно, что при отсутствии жестких факторов отбора, случайный мутационный процесс так же может привнести существенный вклад в изменчивость, и в таком случае свидетельствовать уже не о различии условий обитания, которые могут быть вполне близкими или даже единообразными, как напр., в Пестовском и Пироговском водохранилищах (станции 1.# и 8.#), а о времени разобщения данных акваторий и формирования новых мест обитания моллюсков после расселения их из исходного водоема.

Иными словами, быть свидетельством истории происхождения водоемов, если таковая по каким-либо причинам не ясна.

Таким образом, применение ПЦР- анализа молекулярного полиморфизма моллюсков помимо прикладного - оценки загрязненности и мониторинга экологического состояния водоемов обретает еще один, уже теоретический аспект - исследование происхождения водоемов по данным о расселении и формировании изолированных популяций моллюсков.

Заключение

Неоднородность генотипа и фенотипа особей, входящих в популяцию, имеет большое экологическое значение. В зависимости от конкретных условий больше шансов выжить у особей с определенным набором признаков, которые затем снова восстанавливают всю популяцию.

Полиморфизм может быть обусловлен как внешними факторами, необходимостью приспосабливаться к меняющимся условиям обитания, так и генетическими причинами. Чаще всего невозможно выделить одну причину возникновения внутривидового полиморфизма, как правило, данное явление индуцируется комплексом факторов.

В нашем исследовании на примере Московской области показано существование молекулярного полиморфизма среди популяций пресноводного моллюска Viviparus viviparus L., обитающих в водоемах, различных по своим экологическим характеристикам, гидрологическому состоянию и химическому составу донных отложений. Широкое изучение природных водоемов позволило сделать определенные обобщения о закономерностях межпопуляционного полиморфизма. Особи, принадлежащие к разным популяциям, отличаются друг от друга по набору полиморфных ПЦР-фрагментов ДНК, что соотносится с общим состоянием водоема - чем ближе водоемы по своим экологическим характеристикам или происхождению (или расположению), тем больше сходства на молекулярном уровне проявляют моллюски, обитающие в них.

Как показали наши собственные и имеющиеся в литературе данные, использование молекулярных маркеров полиморфизма актуально для расширения спектра методов биоиндикации и биологического мониторинга природных вод, сохранения и улучшения состояния водоемов, изучения эволюции акваторий и других факторов изоляции и внутривидовой дифференциации гидробионтов. Дальнейшие исследования в этой области позволят выявить дополнительные факторы, влияющие на процесс возникновения генетических различий между популяциями и расширить область практического и теоретического применения столь технологичного и высокоточного метода как ПЦР-анализ генетического полиморфизма гидробионтов.

Выводы

1. Живородка речная Viviparus viviparus L. по сравнению с другими представителями гидробионтов, населяющих водоемы Московской области, является наиболее удобным объектом для изучения внутривидовой дифференциации в связи с его биологическими и молекулярными особенностями.

2. Открытые водоемы Московской области, разнообразные по экологическому состоянию, гидрохимическим и гидрологическим характеристикам, формируют уникальную гидросистему с оптимальными условиями для изучения возможностей метода ПЦР-анализа молекулярного полиморфизма.

3. Подобраны оптимальные условия для амплификации полиморфных фрагментов ДНК речной живородки, выявлена внутрипопуляционная молекулярная однородность моллюсков, обитающих в одном водоеме, и межпопуляционная дифференциация особей из различных водоемов по комплексу специфичных ПЦР-продуктов на электрофореграммах.

4. Степень различия изолированных популяций живородки речной определяется не только загрязненностью и экологического состояния водоемов, но и множеством других факторов (проточность водоемов, температура воды, состав грунта, разнообразие кормовой базы и других, природа которых нами пока не выявлена), влияющих на процесс внутривидовой дифференциации и микроэволюцию пресноводных гидробионтов.

Литература

1. Алтухов Ю. П., Рычков Ю. Г., 1970. Популяционные системы и их структурные компоненты. Генетическая стабильность и изменчивость // Журн. общ. биологии. Т.31. С.507-526.

2. Брагинский Л.П., 1972. Пестициды и жизнь водоемов. Киев, Наукова думка. 179 с.

3. Высоцкая Р.У., Немова Н.Н., 2008. Лизосомы и лизосомальные ферменты рыб. М.: Наука. 284 с.

4. Григорьев А.И., 2008. Экология человека: учебник для вузов. М.: Просвещение. 240 с.

5. ГОСТ Р 53218-2008. Атомно-абсорбционный метод определения содержания тяжелых металлов. М.: Стандартинформ. 2009. 11 с.

6. ГОСТ Р 54503-2011. Вода. Методы определения содержания полихлорированных бифенилов. М.: Стандартинформ. 2013. 32 с.

7. ГОСТ Р 52406-2005. Вода. Определение нефтепродуктов методом газовой хроматографии. М.: Стандартинформ. 2007. 25 с.

8. Дроганов Е.И., Поликарпова Л.В., Дроганова Т.С., Цветков И.Л., Коничев А.С., 2014. Биохимический и молекулярный полиморфизм в популяциях речной живородки (Viviparus viviparus L.) // Вестник МГОУ. Серия «Естественные науки». №2. С. 20-29.

9 Догель В.А., 1981. Зоология беспозвоночных: учебник для ун-тов / ред. Полянский Ю.И. М.: Высшая школа. 606 с.

10. Иваченко Л.Е., 2010. Роль множественных форм ферментов сои в процессе биохимической адаптации к условиям выращивания // Успехи современного естествознания. №9. С. 96-98.

11. Коничев А.С., Цветков И.Л., Попов А.П. и др., 2012. Практикум по молекулярной биологии. М.: КолосС. 151 с.

12. Кутикова Л.А., Старобогатов Я.И., 1977. Определитель пресноводных беспозвоночных европейской части СССР (планктон и бентос). Л.: Гидрометеоиздат. 516 с.

13. Лаврентьева Е.В., Банзаракцаева Т.Г., Раднагуруева А.А. и др., 2012. Основы молекулярных механизмов регуляции генов пептидаз в прокариотической клетке: Учебное пособие. Улан-Удэ. 66 с.

14. МУ 2.1.7.730-99. Гигиеническая оценка качества почвы населенных мест: Методические указания. М.: Минздрав России, 1999. 19 с.

15. Нарочницкий А. Л., 1980. Москва. Энциклопедия. М.: Советская энциклопедия. 688 с.

16. Небел Б., 1993. Наука об окружающей среде. М.: Мир. Т.1. 420 с.

17. Немова Н.Н., Высоцкая. Р.У., 2004. Биохимическая индикация состояния рыб. М.: Наука. 216 с.

18. Парк Д.В., 1973. Биохимия чужеродных соединений. М.: Медицина. 287 с.

19. Патрушев Л.И., Минкевич И.Г., 2007. Проблема размера геномов эукариот // Успехи биологической химии. Т.47. С.293-370.

20. Пыхтеева Е.Г., 2009. Металлотионеин: биологические функции. Роль металлотионеина в транспорте металлов в организме // Актуальные проблемы транспортной медицины. Т.18, №4. С.44-58.

21. Саловарова В.П., Приставка А.А., Берсенева О.А., 2007. .Введение в биохимическую экологию: Учеб. пособие. Иркутск: Иркут. гос. ун-т. 159 с.

22. Стручкова И.В., Брилкина А.А., Веселов А.П., 2011. Регуляция биосинтеза белка: Учебно-методическое пособие. Н.-Новгород: Нижегородский госуниверситет. 101с.

23. Филенко О.Ф., Михеева И.В., 2007. Основы водной токсикологии. М.: Колос. 144 с.

24. Хочачка П., Сомеро Дж., 1988. Биохимическая адаптация / Пер. с англ. М.: Мир. 568 с.

25. Цветков И.Л., Попов А.П., Коничев А.С., 2012. Активность кислой фосфатазы и дезоксирибонуклеазы у гидробионтов под влиянием различных токсических веществ водной среды // Гидробиол. журнал. Т.48, №1. С.95-108. Цветков И.Л. Коничев А.С. 2013 Биохимические и молекулярно- генетические аспекты адаптации гидробионтов: Монография. М.: МГОУ 121 с.

26. Цветков И.Л., Коничев А.С., 2009. Стресс-индуцированная динамика сорбита и активности сопутствующих ферментов в пищеварительной железе живородки речной // Биохимия. 2009. Т.74. Вып.11. С.1548-1554.

27. Чухрай И., 1969. Пирогово // Водоёмы Подмосковья: Справочник Московского общества «Рыболов-спортсмен». М.: Советская Россия. 224 с.

28. Шаплыгина Ю.Н., Курочкина Т.Ф., Насибулина Б.М., 2013. Особенности воздействия тяжелых металлов на донные организмы дельты р. Волга // Естественные науки. Проблемы региональной экологии и природопользования. Т.44, №3. С. 51-60.

29. Шатилина Ж.М., Бедулина Д.С., 2010. Белки теплового шока в механизмах стресс-адаптации у байкальских амфипод и палеарктического Gammarus lacustris Sars: II. Семейство низкомолекулярные (малые) БТШ // Сибирский экологический журнал. №4. С.623-632.

30. Antunes R.S.P., Gomes V.N., Prioli S.M.A.P., Prioli R.A. et al., 2010. Molecular characterization and phylogenetic relationships among species of the genus Brycon (Characiformes: Characidae) from four hydrographic basins in Brazil Genetics and Molecular Research. Vol.9, No2. P.674-684.

31. Guiller A., Arnaud J.-F., Vautrin D., Solignac M., 2000. Highly polymorphic microsatellite markers in the landsnail Helix aspersa (Mollusca Gastropoda) // Molecular Ecology. Vol.9, No8. P.1191-1193.

32. Hartigan J.A., Hartigan P.M., 1985. The dip test of unimodality // Ann. Statist. Vol.13. P.70-84.

33. Maki M., Kitaura Y., Satoh H., Ohkouchi S., Shibata H., 2002. Structures, functions and molecular evolution of the penta-EF-hand Ca2+ binding proteins // Nat. Struct. Biol. Vol.6. Р.89-95.

34. Martin E., Laloux H., Couette G., Alvarez T. et al., 2002. Identification of 1088 New Transposon Insertions of Caenorhabditis elegans: A Pilot Study Toward Large-Scale Screens // Genetics. Vol.162, No1. P.521-524.

35. Raghavana N., Tettelinb H., Millera A., Hostetlerb J., et al., 2007. Nimbus (BgI): An active non-LTR retrotransposon of the Schistosoma mansoni snail host Biomphalaria glabrata // Int. J. Parasitol. Vol.37, No12. P.1307-1318.

36. Sneath P.H.A., 1995. Thirty Years of Numerical Taxonomy // Systematic Biology. Vol.44, No3. Р.281-284.