Исследование эксцизионной репарации оснований ДНК в эмбриональном развитии морского ежа Strongylocentrotus intermedius

/

/

Дипломная работа

Исследование эксцизионной репарации оснований ДНК в эмбриональном развитии морского ежа Strongylocentrotus intermedius

СОДЕРЖАНИЕ

• ВВЕДЕНИЕ
• ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
• 1.1 Повреждения азотистых оснований ДНК
• 1.2 Окисление ДНК. 8-оксогуанин
• 1.3 Дезаминирование оснований. Урацил
• 1.4 Апурин-апиримидиновые сайты
• 1.5 Эксцизионная репарация оснований ДНК
• 1.6 Репарация ДНК в эмбриональном развитии
• 1.7 Эмбриогенез морского ежа
• МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
• 2.1 Реактивы
• 2.2 Дезоксирибоолигонуклеотиды
• 2.3 Ферменты
• 2.4 Стандартные буферы и смеси
• 2.5 Выращивание эмбрионов морских ежей
• 2.6 Приготовление клеточных экстрактов
• 2.7 Измерение общей концентрации белка
• 2.8 Введение 32P метки по 5'-концу ОДН
• 2.9 Хроматографическая очистка меченого ОДН
• 2.10 Электрофоретическая очистка меченого ОДН
• 2.11 Определение выход после очистки и отжиг комплементарных цепей ОДН
• 2.12 Электрофоретический анализ ОДН
• 2.13 Электрофоретический анализ белков
• 2.14 Анализ расщепления ОДН клеточными экстрактами
• 2.15 Анализ ДНК-полимеразной активности экстрактов
• 2.16 Обработка результатов
• 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
• 3.1 Поиск генов, кодирующих ферменты ЭРО в геноме морского ежа
• 3.2 Выращивание эмбрионов морских ежей
• 3.3 Приготовление экстрактов эмбрионов морских ежей
• 3.4 Измерение активности ферментов репарации
• 3.4.1 Активность урацил-ДНК-гликозилазы
• 3.4.2 Активность 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы
• 3.4.3 Активность AP-эндонуклеазы
• 3.4.4 Активность ДНК-полимераз
• ВЫВОДЫ
• СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
• СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

8-oxoGua 7,8-дигидро-8-оксогуанин

Ade аденин

AP апурин/апиримидиновый (сайт)

Cyt цитозин

dN дезоксирибонуклеотиды

dNTP дезоксирибонуклеотидтрифосфат

Gua гуанин

PMSF фенилметансульфонил фторид

SDS додецилсульфат натрия

Tris трис(гидроксиметил)аминометан

Ura урацил

АФК активные формы кислорода

ДТТ 1,4-дитиотреитол

ОДН олигодезоксирибонуклеотид

ПААГ полиакриламидный гель

ЭДТА этилендиаминтетраацетат

ЭРО эксцизионная репарация оснований

ВВЕДЕНИЕ

Система эксцизионной репарации оснований (ЭРО) является одной и ферментативных систем клетки, препятствующих повреждению структуры ДНК. Повреждения происходят во всех клетках, содержащих ДНК, как вследствие экзогенного влияния, так и в ходе нормальных метаболических процессов. В активно пролиферирующих клетках необходимость поддержания интактной структуры ДНК обусловлена высокой интенсивностью процессов репликации. Поэтому большой интерес представляет изучение особенностей ЭРО в эмбриональном развитии живых организмов. эксцизионный репарация морской еж эмбрион

Удобными объектами для изучения молекулярных процессов, происходящих во время развития, являются иглокожие, в частности морские ежи рода Strongylocentrotus. Во-первых, эмбрионы иглокожих в природе подвергаются интенсивному воздействию внешней среды, приводящему к множественным повреждениям ДНК, что предполагает наличие у них высокого уровня активности ферментов репарации. Во-вторых, эмбриогенез морских ежей хорошо и подробно изучен, отработаны методики инкубации большого количества зародышей, позволяющие получать препарат эмбрионов на конкретной стали развития.

Целью данной работы было изучение активностей ключевых ферментов трех этапов эксцизионной репарации оснований в эмбриональном развитии морского ежа Strongylocentrotus intermedius (A. Agassiz, 1863). Нами были поставлены следующие задачи:

- исследовать урацил-ДНК-гликозилазную и оксогуанин-ДНК-гликозилазную активности клеточных экстрактов эмбрионов S. intermedius;

- исследовать активность клеточных экстрактов эмбрионов S. intermedius, расщепляющую ДНК по AP-сайтам;

- исследовать ДНК-полимеразную активность клеточных экстрактов эмбрионов S. intermedius.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ДНК - важнейшее соединение в живом организме, универсальный носитель генетической информации. ДНК в клетке относительно стабильна, однако ежедневно в молекулах ДНК каждой клетки человеческого тела около 100000 звеньев повреждаются за счет разнообразных эндогенных процессов и экзогенных воздействий. Повреждение ДНК может приводить к появлению мутаций, провоцировать гибель клетки или служить толчком к ее злокачественному перерождению. Поэтому одной из важнейших задач в живой клетке является поддержание неповрежденной структуры ДНК. Этим занимаются ферменты, принадлежащие к нескольким системам, объединенным названием «системы репарации ДНК».

Существует несколько главных систем репарации. Реактивация - процесс превращения поврежденных оснований в нормальные без расщепления ДНК и последующего синтеза. Так, например циклобутановые пиримидиновые димеры, образующиеся под действием УФ-облучения, превращаются в два остатка тимидина прокариотическим ферментом фотолиазой. В клетках млекопитающих и E. coli обнаружен целый класс алкилтранфераз, репарирующих некоторые алкилированные основания (при этом происходит перенос алкильной группы на белок). Остальные типы репарации проходят с деградацией участка цепи, содержащего повреждение, и последующим синтезом ДНК. При таких серьезных повреждениях, как двунитевые разрывы, обширные бреши и межцепочечные сшивки, включается система рекомбинационной репарации, при которой используется неповрежденная копия генетического материала, присутствующая в клетке. Система репарации гетеродуплексов узнает неканонические пары в составе ДНК и удаляет их. Наконец существуют две системы эксцизионной репарации - эксцизионная репарация нуклеотидов и эксцизионная репарация оснований (ЭРО). Они отличаются как по субстратной специфичности, так и по механизмам действия. Субстратами для эксцизинной репарации нуклеотидов являются объемные химические аддукты в ДНК, повреждения, вызванные УФ-облучением, и внутрицепочечные сшивки. В ходе этого пути эксцизии подвергается участок ДНК длиной в несколько десятков нуклеотидов; данная система низкоспецифична к типу повреждения. Эксцизионная репарация оснований (ЭРО) напротив, высокоспецифична к повреждению за счет наличия особых ферментов - ДНК-гликозилаз, чувствительных к тому или иному типу повреждения. Субстратами ЭРО являются повреждения, незначительно искажающие структуру ДНК - модифицированные основания, апурин-апиримидиновые сайты (AP-сайты), некоторые гетеродуплексы. Основная особенность, отличающая ЭРО от всех других типов репарации, состоит в том, что поврежденный элемент выщепляется в виде одиночного основания, а не в составе олигонуклеотида.

Рис. 1 Наиболее распространенные модифицированные азотистые основания, возникающие при повреждении ДНК. Продукты дезаминирования: урацил (I), гипоксантин (II), ксантин (III). Продукты окисления: 8-оксогуанин (IV), 2,4-диамино-6-оксо-5-формамидопиримидин (V), 8-оксоаденин (VI), 4,6-диамино-5-формамидопиримидин (VII), тимингликоль (VIII), 5,6-дигидроурацил (IX), 5,6-дигидротимин (X), 5-гидроксиметилурацил (XI). Продукты УФ-облучения: цис-син циклобутановый тиминовый димер (XII). Продукты электрофильного присоединения: 3-метиладенин (XIII), 7-метилгуанин (XIV), 2,4-диамино-6-оксо-5N-метил-5-формамидопиримидин (XV), 1,N⁶-этеноаденин (XVI), 3,N⁴-этеноцитозин (XVII), O⁶-метилгуанин (XVIII). Рисунок предоставлен руководителем работы на условиях лицензии Creative Commons Attribution_ShareAlike 2,5 Generic.

1.1 Повреждения азотистых оснований ДНК

Повреждения ДНК можно условно разделить на спонтанные и идущие под действием внешних генотоксических факторов. Под спонтанным повреждением ДНК понимается такое повреждение, которое может образовываться вследствие нормального метаболизма клетки. Так, сюда относятся процессы дезаминирования, утраты оснований (образование AP-сайтов), окислительного повреждения продуктами кислородного метаболизма и алкилирования эндогенными переносчиками метильной группы. Также к спонтанным можно отнести ошибки, возникающие в процессе репликации. Экзогенные генотоксические факторы (ионизирующая радиация, ультрафиолетовое излучение и реакционноспособные ксенобиотики) часто вызывают такие же или подобные повреждения, поэтому такое деление действительно условно. Например, ионизирующая радиация приводит к радиолизу воды, продукты которого окисляют азотистые основания так же, как и эндогенные метаболиты кислорода, а многие ксенобиотики вступают в реакции электрофильного присоединения с азотистыми основаниями, не отличающиеся принципиально от реакций с эндогенными донорами алкильных групп. К числу поврежденных оснований, возникающих исключительно под действием внешних факторов, можно отнести продукты, появляющиеся в ДНК при облучении в ультрафиолетовом диапазоне, такие как тимидиновые фотодимеры.

На рис. 1 приведены наиболее часто встречающиеся повреждения азотистых оснований ДНК.

1.2 Окисление ДНК. 8-оксогуанин

К числу повреждений, очень часто встречающихся в ДНК, относятся окисленные пурины и пиримидины. Одним из главных реагентов-окислителей является кислород в виде его активных форм. К активным формам кислорода (АФК) относятся супероксид-анион-радикал *O₂-, перекись водорода H₂O₂, гидроксильный радикал *OH и синглетный кислород ¹O₂. Реактивность АФК повышается в ряду O₂ < H₂O₂ < *O₂- < *OH. АФК могут взаимодействовать со всеми типами биомакромолекул и повреждать их [1]. Так, например в случае липидов клеточных мембран АФК способны запускать процесс их перекисного окисления, а в случае ДНК - вносить окислительные повреждения, ведущие к мутациям и изменению генетической информации. Очень чувствительны к АФК ферменты, содержащие в структуре SH-группы, легко поддающиеся окислению.

АФК возникают в клетке при протекании нормальных метаболических процессов (дыхание, метаболизм ксенобиотиков и др.), а также при экзогенном воздействии и в условиях клеточного стресса. При нормальном кислородном дыхании в цепи переноса электронов может происходить восстановление молекулярного кислорода промежуточными продуктами, в основном в комплексе I дыхательной цепи. При этом образуется супероксид-анион-радикал *O₂-, и происходит его утечка в митохондиальный матрикс и цитоплазму. При нормальном клеточном метаболизме такой процесс имеет место, однако процент утечки невелик и то количество АФК, которое при этом образуется, не вызывает серьезных повреждений клеточных структур и генетического материала. В условиях же окислительного стресса утечка АФК из митохондрий значительно усиливается, что приводит к значимым повреждениям органелл клетки и ДНК, вплоть до гибели клетки.

Помимо дыхательной цепи источниками АФК в клетке являются многие ферменты, использующие молекулярный кислород для окисления субстрата (оксидазы). Например, оксидазы макрофагов генерируют *O₂- для борьбы с бактериальными патогенами [2]. В печени, надпочечниках и ряде других тканей содержатся цитохромы P450 - ферменты-оксидазы, использующие молекулярный кислород для окисления ксенобиотиков. Также определенный вклад в производство АФК вносят ферменты, содержащиеся в пероксисомах и лизосомах [3].

Экзогенными источниками АФК в клетке могут быть некоторые ксенобиотики и ионизирующая радиация. Продукты распада радиоактивных элементов представляют собой высокоэнергетические заряженные частицы и фотоны. При проникновении в живую клетку они вызывают радиолиз воды, продуктами которого являются АФК, а также радикалы H* и ряд других соединений. Каждая частица, постепенно тормозясь и отдавая энергию, способна продуцировать множество молекул АФК [1]. Поэтому при воздействии на клетку ионизирующей радиации количество молекул АФК может на порядки превышать то, которое образуется в нормальных условиях. Кроме того, продукты радиолиза сосредоточены вдоль трека проходящей частицы, поэтому высока вероятность повреждения находящихся рядом молекул биополимеров и возрастания локальных концентраций окисленных соединений. В случае ДНК это приводит к образованию кластерных повреждений - модификаций ДНК, расстояние между которыми меньше нескольких нуклеотидов.

АФК различаются как по способности реагировать с ДНК, так и по способности диффундировать в клетке. Так, *OH очень легко вступает в реакции с ДНК и другими соединениями, однако по этой причине срок его жизни очень мал, так как он успевает прореагировать практически сразу после образования. *O₂- и H₂O₂ напротив, менее реакционноспособны, однако могут по этой причине диффундировать на большие расстояния в клетке. В различных частях клетки *O₂- и H₂O₂ могут быть разными способами восстановлены до более реактивного *OH.

Одним из наиболее хорошо изученных окислительных повреждений ДНК является 8-оксогуанин (8-oxoGua), продукт окисления гуанина. Это повреждение образуется при многих способах окислительного повреждения ДНК - при обработке ионами переходных металлов в присутствии O₂ и восстановителей, ?-облучении, обработке пероксинитритом, агентами, индуцирующими образование синглетного кислорода, активированными метаболитами некоторых канцерогенов, УФ-облучении в присутствии фотосенсибилизаторов или H₂O₂ и т.п [4]. Так же было показано что 8-oxoGua в значительном количестве образуется в клетке как при действии генотоксических агентов, так и при эндогенном окислении. С помощью различных методик оценен уровень 8-oxoGua в клетке, который составляет ~1 8-oxoGua/10⁶ Gua [5].

Появление в цепи ДНК остатка 8-oxoGua приводит к тому, что ДНК-полимераза при новом цикле репликации может включить в дочернюю цепь напротив него остаток dAMP вместо остатка dCMP. Таким образом, создается предмутагенный гетеродуплекс 8-oxoGua:Ade. Эта ошибка может быть исправлена при репарации, но если этого не происходит, пара G:C меняется на T:A, то есть возникает точковая мутация. Однако биологическое действие 8-oxoGua не ограничено ошибками репликации. Это поврежденное основание может влиять не только на ДНК-полимеразу, но и на другие ДНК-зависимые ферменты: присутствие 8-oxoGua в последовательности узнавания ингибирует расщепление ДНК некоторыми рестриктазами [6] окисление Gua в последовательности CpG ингибирует метилирование соседнего основания Cyt-метилтрансферазой человека [7] и т. д. Кроме того основание Gua может окисляться не только в самой ДНК, но и в составе мононуклеотидов, например, GTP. Это может приводить к ошибкам трансляции, так как GTP является субстратом для РНК-полимераз а также к нарушению работы GTP-зависимых белков, участвующих во внутриклеточной сигнализации.

1.3 Дезаминирование оснований. Урацил

Другой важный путь повреждения оснований ДНК - дезаминирование. Дезаминированию могут подвергаться основания Cyt, Ade и Gua, однако скорость дезаминирования Cyt в 50-100 раз больше, чем Ade и Gua. Продуктом дезаминирования Cyt является урацил (Ura), а продуктами дезаминирования Ade и Gua - гипоксантин и ксантин соответственно. Ura не входит в число канонических оснований ДНК, однако является таковым для РНК. В двуцепочечной ДНК дезаминирование Cyt проходит главным образом при атаке молекулой H₂O по атому C4 протонированного основания с последующим отщеплением NH₄⁺ [8]. В одноцепочечных участках ДНК возможно присоединение молекулы H₂O по двойной связи C5=C6, что облегчает последующую атаку второй молекулой H₂O по атому C4 с образованием промежуточных продуктов 5-гидро-6-гидроксицитозина и 5-гидро-6-гидроксиурацила. Урацил удаляется из ДНК ферментом урацил-ДНК-гликозилазой (Ung у бактерий, UNG у эукариот). В отсутствие репарации ДНК-полимераза включает dAMP напротив Ura при новом цикле репликации, что приводит к точечной мутации в том случае, если Ura возник при дезаминировании Cyt. Ксантин и гипоксантин также могут быть причинами мутагенеза в клетке, так как полимеразы могут включать напротив этих оснований dAMP [9, 10].

1.4 Апурин-апиримидиновые сайты

Апурин-апиримидиновые (AP-) сайты возникают в ДНК вследствие гидролиза N-гликозидных связей. Это может происходить как спонтанно, так и под действием ферментов-гликозилаз, выщепляющих поврежденные основания в процессе репарации. Спонтанный гидролиз N-гликозидных связей легко происходит в кислой среде, так как ключевым шагом в этом механизме является протонирование азотистого основания. Однако он происходит с достаточной скоростью и при физиологических значениях pH [11, 12]. Скорость потери неодинакова для различных оснований и зависит от pK_a протонируемого атома (N7 в основании Gua, N1 в Ade, N3 в Cyt, O² в Thy). Поэтому при физиологических значениях pH в первую очередь происходит потеря пуриновых оснований, т.е. происходит «апуринизация» ДНК. Скорость апуринизации значительно повышается в случае модифицированных пуринов, несущих постоянный положительный заряд (например, 7-метилгуанина).

AP-сайты обладают высокой цитотоксичностью и мутагенностью, так как, во-первых, они химически нестабильны: после отщепления основания нет ограничений для нуклеофильной атаки по атому С1', что приводит к элиминации 3'-фосфата и образованию одноцепочечного разрыва. Во-вторых, AP сайты эффективно блокируют действие многих ДНК-полимераз, которые при достижении их останавливаются, а затем либо диссоциируют, либо включают напротив них в дочернюю цепь dAMP. Эта закономерность получала название «правило А» и показана для многих полимераз [13].

1.5 Эксцизионная репарация оснований ДНК

Все вышеперечисленные повреждения ДНК в живой клетке удаляются системой эксцизионной репарации оснований. Первый шаг пути эксцизионной репарации - узнавание и выщепление модифицированного основания специальными ферментами, которые носят название ДНК-гликозилаз. При том, что в ДНК может встречаться множество различных повреждений, в природе существует ограниченное количество ДНК-гликозилаз, обладающих более или менее широкой субстратной специфичностью. Так, например 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза эукариот (OGG1) способна выщеплять многие окисленные пурины, а урацил-ДНК-гликозилаза эукариот (UNG) - только остатки урацила. ДНК-гликозилазы катализируют удаление основания по механизму нуклеофильного замещения. В зависимости от типа гликозилазы нуклеофильным агентом может выступать молекула воды или одна из аминогрупп в активном центре фермента [5].

ДНК-гликозилазы делятся на монофункциональные и бифункциональные. Эти типы ферментов отличаются по механизму катализируемой реакции и по продуктам, которые получаются на выходе. Так, монофункциональные гликозилазы катализируют только выщепление азотистого основания с образованием AP-сайта. Нуклеофильным агентом в такой реакции является молекула воды, которая замещает собой азотистое основание (рис. 2А). Бифункциональные гликозилазы после выщепления основания вносят разрыв с 3' стороны от образовавшегося AP-сайта по механизму ?-элиминирования. Эта активность называется AP-лиазной. Продуктом такой реакции является одноцепочечный разрыв с 3'-концевой фосфатной группой и 5'-концевым ненасыщенным альдегидным фрагментом. При этом реакция идет с образованием основания Шиффа между остатком аминокислоты активного центра фермента и С₁' атомом остатка дезоксирибозы. (рис. 2Б). Некоторые бифункциональные гликозилазы катализируют и дальнейшую стадию элиминирования AP-сайта, называемую ?-элиминированием. При этом расщепляется связь между атомом C5' и атомом кислорода фосфатной группы. После этого в ДНК остается одноцепочечный разрыв, обрамленный с обеих сторон фосфатными группами [14] (рис. 2В).

Рис. 2 Расщепление ДНК по AP-сайту AP-эндонуклеазами (А) и AP-лиазами, катализирующими реакцию ?-элиминации (Б) или ?,?-элиминации (В). Рисунок предоставлен руководителем работы на условиях лицензии Creative Commons Attribution_ShareAlike 2,5 Generic.

Продукты реакций, катализируемых ДНК-гликозилазами, не являются непосредственно субстратами для ДНК-полимераз, поэтому в ходе ЭРО подвергаются дальнейшему процессингу. В зависимости от типа ДНК-гликозилазы, работающей на первом шаге, существует несколько путей ЭРО (рис. 3).

Первый путь ЭРО начинается с выщепления основания монофункциональной ДНК-гликозилазой. Получившийся AP-сайт является субстратом для AP-эндонуклеазы, которая гидролизует фосфодиэфирную связь с 5'-стороны от AP-сайта. Это приводит к образованию 3'-концевой OH-группы, служащей субстратом для ДНК-полимераз, и 5'-концевого 2'-дезоксирибо-5'-фосфата (dRP), который блокирует 5'-конец. Дальнейшая репарация может идти либо по «короткозаплаточному», либо по «длиннозаплаточному» пути ЭРО. В первом случае ДНК-полимераза (ДНК-полимераза ? в клетках высших эукариот) встраивает dNMP на место поврежденного звена. Затем остаток dRP удаляется с помощью dRP-лиазной активности, которая в клетках высших эукариот также принадлежит ДНК-полимеразе ?. После этого ДНК-лигаза (в клетках высших эукариот ДНК-лигаза III? в комплексе с вспомогательным белком XRCC1) лигирует получившиеся фрагменты. При длиннозаплаточной ЭРО после встраивания первого dNMP репаративный синтез продолжается с заменой 2-20 нт и вытеснением или деградацией впереди лежащей цепи ДНК; в клетках высших эукариот этот синтез ведется ДНК-полимеразами ? или ? с привлечением вспомогательных факторов (PCNA, RFC, RPA). Вытесненный фрагмент удаляется флэп-эндонуклеазой (FEN1), а затем происходит лигирование последней фосфодиэфирной связи - в клетках высших эукариот это делает ДНК-лигаза I [15].

Рис. 3 Общая схема процесса эксцизионной репарации оснований у высших эукариот [5]

Второй путь ЭРО начинается с выщепления основания бифункциональной ДНК-гликозилазой. В случае ?-элиминирования AP-сайта альдегидный фрагмент вместе с фосфатной группой удаляется также AP-эндонуклеазой. В случае ?-элиминирования 3'-фосфатные группы выщепляются из ДНК фосфатазной активностью, которая у E. coli принадлежит опять же AP-эндонуклеазам, а в клетках человека -- полинуклеотидкиназе/3'-фосфатазе. Таким образом в ДНК образуется однонуклеотдиная брешь, которая может застраиваться как по короткозаплаточному, так и по длиннозаплаточному пути ЭРО. Отличие короткозаплаточного пути в данном случае будет в том, что в случае бифункциональных гликозилаз не требуется dRP-лиазная активность, так как уже на стадии ?-элиминирования образуется свободная 5'-фосфатная группа [15].

Так же существуют пути ЭРО, независимые от ДНК-гликозилаз («инцизионная репарация нуклеотидов»), в ходе которой AP-эндонуклеаза расщепляет фосфодиэфирную связь с 3'-стороны от повреждения, а затем идет синтез с вытеснением цепи.

2.6 Репарация ДНК в эмбриональном развитии

Процессы репарации ДНК протекают на всех стадиях развития организма, так как поддержание интактной структуры носителя генетической информации является одним из ключевых условий выживания клетки. Однако интенсивность этих процессов не одинакова для разных органов и тканей, а также в разные периоды жизни организма. Это связано в первую очередь с тем, что при активной репликации генетического материала в ДНК возникает множество ошибок и повреждений, которые необходимо оперативно удалять, чтобы клетка безошибочно закончила деление. Репликативные ДНК-полимеразы с определенной долей вероятности включают в состав вновь синтезируемой цепочки неканонические азотистые основания, например, Ura. Кроме того, любая ДНК-полимераза может ошибаться и включать некомплементраный нуклеотид с образованием неканонической пары. При клеточном делении активно идут процессы синтеза всех возможных видов биологческих молекул, поэтому высока вероятность повреждения ДНК различными клеточными метаболитами. Все это может привести к мутациям, поэтому процессы репарации приобретают особое значение во время активного клеточного деления. Для некоторых ДНК-гликолилаз показана возможность участия в репарации непосредственно в репликативной вилке. Так например человеческая аденин-ДНК-гликозилаза гетеродуплексов (MUTYH) [16] связывается с белками репликации PCNA и RPA, что говорит о сочетании процессов синтеза и репарации. Для нематод Caenorhabditis elegans показана взаимосвязь между активностью урацил-ДНК-гликозилазы и одной из контрольных точек клеточного цикла, останавливающей клеточное деление и запускающей апоптоз при сильном повреждении ДНК [17].

Очевидно, что клеточное деление, а, значит, и процессы репликации ДНК наиболее интенсивно протекают на стадии эмбрионального развития. Поэтому особый интерес вызывают работы, направленные на исследование активности различных ферментов репарации в процессе эмбриогенеза растений и животных. При исследовании клеток мозга эмбрионов мышей было показано, что экспрессия гена OGG1 наблюдалась в строго определенной зоне активно делящихся потомков эпендимных клеток. При этом уже на стадии дифференцировки клеток происходил резкий спад уровня экспрессии. [18] Для N-метилпурин-ДНК гликозилазы млекопитающих (MPG) также известно, что экспрессия ее гена максимальна в активно пролиферирующих клетках, в частности, в клетках зародышевого пути. Существуют данные, указывающие на необходимость присутствия MPG для нормального протекания процесса клеточного деления. [19] Интересно, что гомолог этого белка из растений, 3-метиладанин-ДНК гликозилаза Arabidopsis thaliana, экспрессируется в двух местах - в меристемной ткани зародыша, дающей начало эндосперму, и в тканях листьев взрослого организма. [20] Для UNG в культуре клеток человека показано возрастание экспрессии с ростом уровня пролиферации клеток [21].

В целом можно сказать, что во многих исследованиях отмечается корреляция между уровнем пролиферации клеток и уровнем активности различных ферментов репарации. При этом зачастую с развитием организма этот уровень значительно снижается. Многие исследователи отмечают, что снижение активности систем репарации во взрослом организме может быть одним из механизмов старения. Однако высокий уровень экспрессии и активности ДНК-гликозилаз может быть связан не только с необходимостью поддержания неповрежденной структуры ДНК при репликации. ДНК-гликозилазы могут быть вовлечены и в другие клеточные процессы, протекающие на стадии эмбриогенеза. Так, у растений существует уникальная ДНК-гликозилаза DEMETER (DME), удаляющая из ДНК остатки 5-метилцитозина (mCyt). Исследование мутантов по этому белку в Arabidopsis thaliana показало, что на выживаемость потомства влияют только мутации в материнском аллеле DME. [22] Это связано с тем, что метилирование Cyt по положению C5 - ключевой механизм импритинга генов. Введение метильной «метки» приводит к ингибированию экспрессии импритированного гена, а удаление метки - к ее активации. Ген DME экспрессируется в центральной клетке женского гаметофита, дающей начало эндосперму, и белок DME деметилирует промоторную область гена MEDEA, активируя его транскрипцию.

Хотя у животных нет гомологов белка DME, различные ДНК-гликозилазы животных также могут быть вовлечены в процессы деметилирования ДНК. Особый интерес представляет механизм деметилирования ДНК у Danio rerio -- рыбы семейства карповых, которая широко используется как модельный организм в биологии развития позвоночных. На первом этапе остаток mCyt подвергается дезаминированию 5-метилцитозиндезаминазой (AID) с образованием остатка Thy, который затем удаляется из ДНК активностью T:G-специфичной тимин-ДНК-гликозилазы (MBD4). При этом функциональное взаимодействие этих ферментов стимулируется белковым фактором GADD45 [23]. Интересно, что для MBD4 человека показана дополнительная активность по удалению mCyt из ДНК [24]. В куриных эмбрионах деметилирование ДНК осуществляется белковым комплексом, в состав которого входят несколько ферментов, в том числе 5-метилцитозин-ДНК-гликозилаза и несколько РНК-геликаз, и CpG-богатая РНК. 5-метилцитозин-ДНК-гликозилаза куриных эмбрионов является гомологична MBD4 человека и обладает активностью как в отношении mCyt, так и в отношении Thy в парах T:G, однако присутствие других участников комплекса стимулирует первую активность и ингибирует вторую [25]. Предпочтительным субстратом для этого комплекса является полуметилированная ДНК, которая возникает в клетке при репликации, когда материнская цепочка метилирована а дочерняя - еще нет [26]. Для всех ферментов и РНК, входящих в состав деметилирующего комплекса, показана преимущественная транскрипция в активно пролиферирующих клетках эмбриона [27].

Таким образом, репарация в эмбриогенезе растений и животных представляет большой интерес для исследования. Одним из распространенных и хорошо изученных объектов эмбриологических исследований являются морские ежи рода Strongylocentrotus (тип Echinodermata, класс Echinoidea, отряд Echinoida, семйство Strongylocentrotidae). Это очень удобный объект для подобной работы, потому что на данный момент известно достаточно много о его эмбриональном развитии, как на уровне морфологии, так и на уровне взаимодействия генов.

2.7 Эмбриогенез морского ежа

После оплодотворения вновь образованный эмбрион морского ежа подвергается полному, радиальному голобластическому дроблению. Первое и второе деление проходят в перпендикулярных друг другу меридиональных плоскостях. После них образуются четыре бластомера, которые затем делятся в экваториальной плоскости. Это третье деление разбивает эмбрион на две «полусферы» - анимальную и вегетативную, соответствующие анимальному и вегетативному полюсам эмбриона. На этой стадии формируются восемь равных по размеру бластомеров, что говорит о равномерности деления. Однако уже при следующем делении формируются клетки, отличающиеся по размеру. Четыре клетки анимального яруса эмбриона делятся в меридиональном направлении, формируя восемь одинаковых по размеру клеток, называемых мезомерами. При этом клетки вегетативного яруса делятся в экваториальном направлении и формируют два клеточных слоя, один из которых представлен клетками большого размера, называемых макромерами, а другой мелкими клетками - микромерами, расположенными полярно. При следующем делении веретено дробления мезомеров проходит экваториально, вследствие чего образуются два слоя, an₁ и an₂, клетки в которых расположены в шахматном порядке. Макромеры делятся меридионально, формируя пласт из восьми клеток, подстилающий an₂, микромеры также делятся, однако несколько позже, формируя небольшой кластер на вегетативном полюсе. Веретена 6-го деления проходят во всех клетках экваториально, а 7-го - меридионально. Это приводит к образованию 128-клеточной бластулы.

Рис. 4 Схема дробления эмбриона морского ежа [28].

Стадия бластулы начинается с 128 клеток. Бластула представляет собой полую сферу, центральная полость которой (бластоцель) заполнена жидкостью. Бластулу формирует одноклеточный слой, таким образом, каждая клетка находится в контакте как с жидкостью бластоцеля так и с оболочкой оплодотворения. Бластула ограничена в объеме этой оболочкой, поэтому с каждым следующим делением размер клеток становится все меньше. Клеточный слой утончается, в то время как количество клеток в нем растет. На этом этапе все клетки делятся синхронно. После 9-10-го деления бластулы фаза синхронного деления заканчивается, и на внешней поверхности бластулы формируются множественные реснички [29]. При этом бластула начинает вращаться внутри оболочки оплодотворения. В клетках анимальной части начинается синтез и секреция особого белка, который разрушает оболочку оплодотворения, и бластула «вылупляется» из нее. Далее зародыш становится подвижным. [30].

Вскоре после вылупления вегетативная сторона зародыша уплощается и утолщается, он утрачивает сферическую форму. Затем в бластоцель мигрируют клетки первичной мезенхимы, происходящие из материала микромеров. Зетам происходит инвагинация стенки бластулы с образованием первичной кишки (архетерона), который растет через бластоцель к анимальному полюсу. (гаструляция). Несколько позже анимальная стенка уплощается, конец архетерона приближается к ее внутренней поверхности. Из этого участка архетерона в бластоцель мигрируют клетки вторичной мезенхимы, дающие начало личиночному скелету. В итоге формируется билатерально симметричная личинка (призма).

В ходе дельнейшего развития ветви скелетных спикул входят в контакт с эктодермой и индуцируют образование двух пар выростов - так называемых рук. С появления закладки первой пары рук личинку принято называть плутеусом или эхиноплутеусом. Вскоре после этого в эктодерме появляются первые нейроны, происходит дифференциация пищеварительного тракта и возникает ротовое отверстие. На этом заканчивается ранее развитие эмбриона и личинка переходит к активному питанию.

Рис. Схематичное изображение плутеуса морского ежа рода Strongylocentrotus [28].

Описанные морфологические преобразования сопровождаются изменением содержания различных веществ в клетках эмбриона. Во время дробления бластулы зародыш использует фонд материнских ферментов (например, ДНК-полимераз), запасенных в икре. Постепенно этот фонд расходуется, материнские ДНК-полимеразы заменяются вновь синтезированными. Кроме того, расходуется запас питательных веществ. Питательные белки в икре морского ежа по большей части представлены главным желточным белком (major yolk protein, MYP).[31] Он состоит 1346 аминокислот и имеет молекулярную массу ~159 кДа. Этот белок относится к семейству трансферринов и содержит сайт связывания ионов Fe³⁺. В процессе развития MYP подвергается протеолитическому расщеплению по специфическим сайтам. [32] Это может приводить к высвобождению ионов железа, и индуцировать окислительные повреждения ДНК эмбриона. Кроме того, по ходу развития изменяется состав среды, с которой контактирует эмбрион. Если первые 12 часов эмбрион находится под оболочкой оплодотворения, защищающей в некоторой степени его от многих внешних воздействий, то после вылупления бластулы зародыш оказывается свободно плавающим в морской воде, в которой содержатся множество агентов, способных повредить ДНК.

Таким образом, развивающемуся эмбриону морского ежа необходимо наличие эффективных систем репарации ДНК. Одним из этапов исследования этих систем является определение наличия и измерение активностей ключевых ферментов репарации ДНК.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Реактивы

В работе использовали трис(гидроксиметил)аминометан (Tris) борную кислоту, персульфат аммония, фенилметилсульфонилфторид (PMSF), тритон Х-100, глицерин (все - «Helicon», Россия), этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) 1,4-дитиотреитол (ДТТ) (все - «Sigma», США), мочевину («ICN Biomedicals», США), акриламид, бромфеноловый синий, ксиленцианол, формамид, LiClO₄, ацетон (все -- «Реахим», Россия), MgCl₂ («Serva», Швейцария), г-[32P]ATP с удельной активностью 1,43 МБк/мкл (Лаборатория биотехнологии ИХБФМ СО РАН), остальные реактивы и растворители квалификации х.ч. и ос.ч. отечественного производства. Для очистки меченых олигодезоксирибонуклеотидов (ОДН) после введения радиоактивной метки использовали сорбент С18 NenSorb («PerkinElmer Life Sciences», США)

2.2 Дезоксирибоолигонуклеотиды

В работе использовали предоставленные руководителем работы ОДН следующих последовательностей:

23oG: 5'-CTCTCCCTTCXCTCCTTTCCTCT-3' (X = 8-oxoGua)

23F: 5'-CTCTCCCTTCXCTCCTTTCCTCT-3'(X = (3-гидрокситетрагидрофуран- 2-ил)метилфосфат, THF)

23U: 5'-CTCTCCCTTCXCTCCTTTCCTCT-3' (X = урацил)

23G: 5'-CTCTCCCTTCGCTCCTTTCCTCT-3'

23C: 5'-CTCTCCCTTCCCTCCTTTCCTCT-3'

23comp: 5'-AGAGGAAAGGAGCGAAGGGAGAG-3'

Primer 1 5'-CTCTCCCTTC-3'

Primer 2 5'-CTCCTTTCCTCT-3'

Template 5'-AGAGGAAAGGAGTGAAGGGAGAG-3'

2.3 Ферменты

В работе использовали полинуклеотидкиназу бактериофага T4 (10000 ед. акт./мл; «Биосан», Россия), Ung E. coli (1000 ед. акт./мл; «New England Biolabs», США), Fpg E. coli (130 мкМ), APEX1 человека (115 мкМ) и ДНК-полимераза человека (89 мкМ) предоставленные руководителем работы.

2.4 Стандартные буферы и смеси

В работе использовали следующие стандартные буферы и смеси, далее приводящиеся без расшифровки состава:

FDLB 80%-ный (v/v) формамид, 20 мМ Na-ЭДТА, 0,1%-ный (w/v) ксиленцианол, 0,1%-ный (w/v) бромфеноловый синий

TBE 90 мМ Tris, 90 мМ борная кислота, 2 мМ ЭДТА

0,1ЧTE 1 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 мМ ЭДТА

2.5 Выращивание эмбрионов морских ежей

Все операции проводили при 18°С. Для выращивания эмбрионов у взрослых половозрелых особей S. intermedius, собранных в заливе Петра Великого в районе морской экспериментальной станции ТИБОХ ДВО РАН, инициировали вымет гамет путем встряхивания животных. Затем смешивали икру и сперматозоиды из расчета 2-5 мл суспензии спермы на 100 мл густой суспензии яйцеклеток, выдерживали 1-2 мин. и разбавляли до 1 л морской водой, профильтрованной через фильтровальную бумагу. После оседания клеток промывали морской водой 2-3 раза. Контроль эффективности оплодотворения проводили, подсчитывая процентное соотношение оплодотворенных клеток в пробе, пробы с эффективностью больше 90-95% использовали для дальнейших экспериментов. Эмбрионы выращивали в открытом сосуде объемом 10 л при постоянном перемешивании мешалкой со скоростью 50 об./мин. Начальная концентрация эмбрионов составляла 3000 шт/мл. После стадии вылупления бластулы эмбрионы разбавляли в два раза, концентрация составляла 1200-1500 шт/мл. Через определенные промежутки времени, согласно методике [33] из инкубационного сосуда отбирали от 400 до 1500 мл (в зависимости от разбавления), и центрифугировали при 2000Чg до оседания клеток. Осадки замораживали при -20°C, затем переносили в -70°C для хранения.

2.6 Приготовление клеточных экстрактов

Для лизирования размороженные во льду клетки смешивали с лизисным буфером (10 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 1 М NaCl, 1 мМ ДТТ, 1 мМ ЭДТА, 0,5%-ный тритон Х-100, 0,3 мМ PMSF) в объемном соотношении 1:5. Смесь подвергали гомогенизации, последовательно пропуская через шприцы с разным диаметром отверстия игл (0,8, 0,7, 0,6, и 0,4 мм). Через каждую иглу смесь пропускали два раза. Все операции проводились на льду. Полученные гомогенаты центрифугировали в течение 20 мин. при 14000Чg при температуре 4°C. Супернатант диализовали в мешках с размером пор, соответствующим 1,5 кДа (Sigma) против 2 смен по 1 л 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0) при 15°C в два этапа: первый - в течение 2 ч., второй в течение ночи. К экстрактам добавляли ДТТ до концентрации 1 мМ и глицерин до 9%, расфасовывали порциями по 1 мл и хранили при -70°C.

2.7 Измерение общей концентрации белка

Содержание белка в экстрактах измеряли методом окрашивания на бумаге Whatman 3MM. Готовили стандартные растворы бычьего сывороточного альбумина с концентрациями 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 мг/мл и наносили на бумагу капли каждого раствора размером по 2 мкл. Экстракты разводили в 10 раз и также наносили на бумагу по 2 мкл. Затем бумагу смачивали ацетоном, высушивали под тягой, и замачивали в растворе 0,25%-го кумасси голубого R250 в 45%-ном метаноле и 10%-ной уксусной кислоте в течение 5 мин. Бумагу отмывали раствором 20%-го метанола и 5%-ной уксусной кислоты, затем споласкивали водой и высушивали. Полученный образец сканировали и обрабатывали результат в программе «Quantity One» v4.6.3 («Bio-Rad»).

2.8 Введение 32P метки по 5'-концу ОДН

Фосфорилирование ОДН проводили в буфере следующего состава: 70 мМ Tris-HCl (pH 7,6), 10 мМ MgCl₂, 100 мМ KCl, 1 мМ 2-меркаптоэтанол. На 200 пмоль ОДН в объеме 10-50 мкл добавляли 20 ед. акт. полинуклеотидкиназы бактериофага Т4 и 5 МБк г[³²P]-ATP (примерно 3,5 пмоль). После инкубации в течение 40 мин. при 37°C реакцию останавливали прогреванием в течение 2 мин при 95°C, отбирали 1 мкл реакционной смеси для последующего определения выхода продукта.

2.9 Хроматографическая очистка меченого ОДН

Меченые ОДН ^*23oG, ^*23F, ^*23C и ^*23G отделяли от невключившегося г[³²P]-ATP обращеннофазовой хроматографией на сорбенте С₁₈ NenSorb. Перед нанесением образца 200 мкл сорбента, упакованного в колонку, смачивали 1 мл метанола, затем 1 мл бидистиллированной воды, а затем уравновешивали 2 мл буфера, содержащего 100 мМ Tris-HCl (pH 7,5) и 1 мМ ЭДТА. К реакционной смеси добавляли 500 мкл того же буфера. После нанесения образца колонку промывали последовательно 2 мл того же буфера и 2 мл воды. Меченый ОДН элюировали с колонки 50%-ным метанолом в объеме 1 мл. Затем очищенный ОДН упаривали досуха под вакуумом (Concentrator plus, Eppendorf, Германия) и растворяли в 50 мкл буфера 0,1ЧTE.

2.10 Электрофоретическая очистка меченого ОДН

Меченый ОДН ^*23U отделяли от невключившегося г[³²P]-ATP и других продуктов электрофоретически. Для этого реакционную смесь, объем которой по возможности был минимален, наносили на полиакриламидный гель (ПААГ) и проводили электрофорез (разд. 3.12). Фрагменты геля, содержащие ОДН, измельчали, добавляли 200-300 мкл воды и элюировали ОДН в течение ночи, затем отделали элюат центрифугированием при 13000 об/мин. К нему добавляли 1,2 мл 2%-го раствора LiClO4 в ацетоне и оставляли на ночь при -20°C. После центрифугирования в течение 10 мин. при 13000 об./мин. супернатант сливали, осадка трижды промывали, добавляя каждый раз 1 мл ацетона и центрифугируя в тех же условиях. После последней промывки осадок досушивали под вакуумом и растворяли в 0,1ЧTE в объеме, соответствующем объему реакционной смеси, использованной для фосфорилирования ОДН.

2.11 Определение выход после очистки и отжиг комплементарных цепей ОДН

Для определения выхода отбирали 1 мкл очищенного ОДН и анализировали его и аликвоту, отобранную непосредственно после фосфорилирования, гель-электрофорезом в денатурирующих условиях (разд.3.12). В случае, если для дальнейших экспериментов был необходим одноцепочечный ОДН, его концентрацию доводили до 500 нМ добавлением буфера 0,1ЧTE (pH 8,0). В случае, когда ОДН должен был быть двуцепочечным, проводили отжиг с двукратным молярным избытком немеченой комплементарной цепи в следующем режиме: 1 мин при 95°C, 10 мин при 37°C, 30 мин при комнатной температуре. Конечную концентрацию дуплекса приводили к 500 нМ добавлением буфера 0,1ЧTE (pH 8,0). Полученный дуплекc хранили при -20°C.

2.12 Электрофоретический анализ ОДН

При проведении гель-электрофореза в денатурирующих условиях использовали 20%-ном ПААГ (соотношение акриламид:бис-акриламид 19:1), содержащий 7,2 М мочевину и буфер TBE. Электрофорез проводили в полиакриламидной пластине толщиной 0,4-0,8 мм и длиной 20-30 см в буфере TBE при напряжении 600-1000 В без специального охлаждения. После разделения продуктов реакции в геле радиоактивность полос определяли радиолюминесцентным сканированием экрана «Image Screen K» («Kodak», США) с использованием системы «Molecular Imager FX» («Bio-Rad Laboratories», США). Результаты обсчитывали с использованием программы «Quantity One» v4.6.3 («Bio-Rad»)

2.13 Электрофоретический анализ белков

Содержание мажорных полос высокомолекулярного белка в экстрактах определяли электрофорезом в ПААГ (соотношение акриламид:бис-акриламид 39:1) с электродным буфером 25 мМ Tris-глицин (pH 8.3) в системе Лэммли: концентрирующий гель - 4% ПААГ, 125 мМ Tris-HCl (pH 6,8), 0,1% SDS; разделяющий гель - 12% ПААГ, 375 мM Tris-HCl (pH 8,8), 0,1% SDS. Электрофорез вели при 200 В в течение 40 мин. После электрофореза гель окрашивали в течение ночи в растворе 0,1% Кумасси бриллиантового голубого R250 в 40% этаноле/10% уксусной кислоте. Отмывыли раствором 40% этанол/10% уксусная кислота 4 раза по 15 мин.

2.14 Анализ расщепления ОДН клеточными экстрактами

Для анализа расщепления ОДН клеточными экстрактами к размороженному экстракту добавляли меченый субстрат до концентрации 50 нМ. Реакционную смесь (50 мкл) инкубировали при 37°C, отбирая аликвоты (5 мкл) через 2, 5, 10, 20 мин. При анализе расщепления субстратов ^*23U и ^*23oG/23comp к реакционной смеси добавляли ЭДТА до концентрации 5 мМ. Для учета неспецифической деградации субстрата клеточные экстракты параллельно инкубировали с контрольным ОДН, не содержащим повреждения. Реакцию останавливали добавлением 5 мкл 0,2 M NaOH и прогреванием при 95°C в течение 2 мин. Затем раствор нейтрализовали добавлением 5 мкл 0,2 M HCl. К аликвоте добавляли 8 мкл раствора FDLB, продукты реакции анализировали электрофорезом в 20%-ном ПААГ (разд. 3.12). При анализе расщепления субстрата ^*23F/23comp реакцию останавливали добавлением 5 мкл раствора FDLB и прогреванием при 95°C в течение 2 мин. Продукты реакции анализировали электрофорезом в 20%-ном ПААГ (разд.3.12).

2.15 Анализ ДНК-полимеразной активности экстрактов

Для определения полимеразной активности был сконструирован субстрат, состоящий из 23-звенной ДНК-матрицы и двух праймеров, в 10 и 12 нуклеотидов длинной, между которыми находилась однонуклеотидная брешь. (*Primer1*Primer2/Template) Праймер 1 был помечен радиоактивной меткой по 5'-концу, 3'-конец оставался свободным. Реакцию вели в буфере, содержащем 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 10 мМ МgCl₂, 1 мM ДТТ, 25 мМ KCl, 100 мкМ dATP. Концентрация субстрата составляла 100 нМ. Реакционную смесь (20 мкл) инкубировали при 20°C в течение 5 мин. Реакцию останавливали добавлением 10 мкл раствора FDLB и прогреванием при 95°C в течение 2 мин. Продукты реакции анализировали электрофорезом в 20%-ном ПААГ (разд. 3.12)

2.16 Обработка результатов

Данные, полученные при обсчете радиоавтографов гелей, были использованы для построения графиков накопления продуктов реакции в программе SigmaPlot v9.0 (SPSS, США) методом регрессии к линейной функции. Тангенс угла наклона получившихся прямых брался за скорость реакции. Скорости расщепления неспецифического субстрата вычиталась из скорости расщепления специфического. Из трех наборов данных, полученных по трем независимым повторам эксперимента, вычислялась стандартная ошибка параметров уравнения регрессии.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Поиск генов, кодирующих ферменты ЭРО в геноме морского ежа

В базе данных GenBank при помощи алгоритма BLAST был проведен поиск последовательностей, гомологичных основным белкам ЭРО человека и E. coli, в полностью секвенированном геноме близкородственного вида S. purpuratus. Результаты поиска приведены в табл. 1, где показаны последовательности человека и E. coli и соответствующие им последовательности S. purpuratus, которые при выравнивании дали общую оценку (total score) > 200. Как видно, в геноме S. purpuratus содержатся ДНК-гликозилазы суперсемейств Ung и Nth, и полностью отсутствуют представители суперсемейства Fpg/Nei. Также не было обнаружено гомологов ДНК-гликозилаз, удаляющих алкилированные основания (AlkA и Tag E. coli, MPG человека). Возможно, репарация алкилированных оснований у морских ежей идет по другим путям, например, с использованием окислительных деметилаз. В отличие от клеток человека, где нет гомологов АП-эндонуклеазы Nfo, у S. purpuratus присутствуют АП-эндонуклеазы обоих суперсемейств -- Xth и Nfo. Были обнаружены также гомологи ДНК-полимераз и ДНК-лигаз человека, принимающих участие в ЭРО, однако отсутствовал гомолог эндонуклеазы FEN1, необходимый для длиннозаплаточного пути ЭРО. В целом можно сказать, что S. purpuratus и, скорее всего, S. intermedius обладают полным набором ферментов, необходимых для осуществления короткозаплаточной ЭРО для большинства повреждений, которые репарируются по этому пути в организме человека.

Табл. 1 Гомологи основных ферментов ЭРО в геноме S. purpuratus

^*Даны только те последовательности человека и E. coli, для которых присутствуют гомологи в геноме S. purpuratus с общей оценкой выравнивания > 200.

^**Приведены обозначения геномных локусов S. purpuratus в базе данных GanBank.

^***Каталитическая субъединица.

3.2 Выращивание эмбрионов морских ежей

Исследование активности ферментов репарации проводилось на клеточных экстрактах, полученных из эмбрионов морского ежа S. intermedius на разных стадиях развития. Выращивание эмбрионов осуществлялось на базе морской экспериментальной станции Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН. Для получения половых клеток морского ежа половозрелых самок и самцов, собранных со дна бухты около морской станции, подвергали легкой тряске, после чего они начинали выделять икру и сперму. Половые продукты собирали в ёмкости с фильтрованной морской водой. Клеткам давали осесть, затем запускали искусственное оплодотворение.[33] Оплодотворение и выращивание эмбрионов проводили при оптимальной температуре развития 18°С как описано в разделе «Материалы и методы». Описанная техника искусственного оплодотворения является общепринятой, ее употребляют с теми или иными модификациями все исследователи.

Признаком успешного оплодотворения является отхождения желточной оболочки от поверхности плазматической мембраны и образование перивителлинового пространства. Этот процесс называют формированием оболочки оплодотворения. Для контроля эффективности оплодотворения из смеси отбирали аликвоту 10-20 мкл, рассматривали под бинокулярной лупой и подсчитывали количество яйцеклеток с оболочкой оплодотворения и без нее.

Затем эмбрионы инкубировали в сосуде при интенсивном перемешивании. Начальная концентрация эмбрионов составляла 3000 шт/мл. После стадии вылупления бластулы эмбрионы разбавляли в два раза. Необходимость разбавления связана с тем, что после вылупления бластулы формирующееся эмбрионы начинают выделять в окружающую среду органические вещества, высокая концентрация которых может быть токсичной для них. Через определенные промежутки времени из инкубационного сосуда отбирали эмбрионы. В итоге были получены образцы, соответствующие 12 стадиям развития (табл. 2).

Табл. 2 Стадии развития морского ежа

3.3 Приготовление экстрактов эмбрионов морских ежей

Приготовление экстракта включало несколько этапов (рис. 5).

Рис. 5. Блок-схема процедуры получения клеточных экстрактов морского ежа

На первом этапе икру, сперму и эмбрионы морского ежа подвергали лизису. Для этого их смешивали с лизисным буфером и пропускали через шприцы с постепенно уменьшающимся диаметром отверстия иглы. Постепенно смесь становилась все более жидкой и прозрачной, так что на выходе получался клеточный гомогенат. Для минимизации повреждения белков все операции проводились во льду, все инструменты предварительно охлаждались, а в состав лизисного буфера был включен ингибитор протеаз PMSF и ДТТ, защищающий белки от окислительного повреждения. Из полученного гомогената остатки клеточных структур удаляли центрифугированием, а супернатант диализовали против буфера с низкой ионной силой. Аналогичная процедура приготовления экстрактов с успехом используется для исследования активностей нуклеаз в ходе эмбрионального развития морского ежа [34].

Полученные экстракты представляли собой полупрозрачную опалесцирующую вязкую жидкость. В них была измерена концентрация белка. Измерение концентрации белка проводилось в два этапа. Сначала общая концентрация белка была измерена методом окрашивания реагентом Бредфорда на бумаге Whatman 3MM (разд. 3.7). Однако в общую концентрацию большой вклад вносят высокомолекулярные питательные белки, такие как главный белок желтка MYP (159кДа). Их концентрация максимальна в неоплодотворенном яйце, и затем постепенно снижается в процессе развития. Чтобы учесть вклад высокомолекулярных белков, экстракты были проанализированы с помощью электрофореза в системе Лэммли (разд. 3.13), и концентрации белка были скорректированы с тем, чтобы не учитывать MYP. Полученные данные представлены в табл. 3.

Табл. 3 Общая концентрация белка в экстрактах эмбрионов на разных стадиях развития

3.4 Измерение активности ферментов репарации

В литературе имеется множество данных, указывающих на повышенный уровень экспрессии и активности различных гликозилаз и других ферментов эксцизионной репарации нуклеотидов в активно делящихся и дифференцирующихся клетках эмбрионов различных животных. Для отработки методики измерения активности ферментов репарации в полученных экстрактах на первом этапе были выбраны три 23-звенных ОДН-субстрата, содержащие в позиции 10 одно из повреждений: 8-oxoGua, Ura и THF - аналог AP-сайта, устойчивый к AP-лиазной активности, но расщепляемый AP-эндонуклеазами. Последовательности нуклеотидов в субстрате за исключением повреждения были одинаковы. Субстрат инкубировали с клеточным экстрактом и через определенные промежутки времени отбирали аликвоты для анализа. В случае субстратов, содержащих Ura или 8-oxoGua, анализируемые образцы прогревали в присутствии щелочи. Это связано с тем что урацил-ДНК гликозилаза является монофункциональной, то есть катализирует только стадию выщепления азотистого основания, и ее продуктом является AP-сайт. Олигонуклеотид, содержащий АР-сайт нельзя электрофоретически отделить от интактного субстрата. Однако в щелочных условиях при высокой температуре AP-сайт быстро подвергается ?-элиминированию, что приводит к разрыву цепи ДНК. 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза является бифункциональной, то есть катализирует помимо стадии выщепления основания еще и стадию ?-элиминирования, однако ее AP-лиазная активность намного ниже гликозилазной, поэтому в случае 8-oxoGua-субстрата образцы также обрабатывали щелочью. В качестве контроля был взят олигонуклеотид с той же последовательностью, что и в поврежденных субстратах, однако содержащий вместо повреждения основание Cyt (для Ura-субстрата) или Gua (для 8-oxoGua-субстрата). Для соблюдения одинаковых условий эксперимента контрольные пробы также инкубировали со щелочью при нагревании.

3.4.1 Активность урацил-ДНК-гликозилазы

Первая серия экспериментов была направлена на выявление активности урацил-ДНК-гликозилазы, которая удаляет остатки Ura как из двуцепочечной, так и из одноцеплчечной ДНК, причем одноцепочечная ДНК является более предпочтительным субстратом. Поэтому в качестве субстрата был использован 23-звенный одноцепочечный ОДН ^*23U, содержащий один остаток Ura в положении 10 с 5'-конца. Поскольку в клеточных экстрактах присутствуют различные ферменты, в том числе нуклеазы, неспецифически разрушающие нуклеиновые кислоты, перед каждым экспериментом в реакционную смесь добавляли ЭДТА -- соединение, хелатирующее дивалентные катионы и ингибирующее многие нуклеазы, но не влияющее на активность ДНК-гликозилаз. На рис. 6 представлен результат типичного эксперимента.

Рис. 6. А - радиоавтограф геля после электрофоретического разделения продуктов реакции расщепления ОДН ^*23U и контрольного ОДН *23C экстрактом эмбрионов S. intermedius (стадия 10). Дорожки 1-7 - субстрат ^*23U после 5, 10, 20, 30, 60, 90 и 120 мин. инкубации с экстрактом, дорожки 8-10 - субстрат *23C после 2, 20 и 120 мин. инкубации с экстрактом. S - субстрат, P - продукт реакции. Б - график зависимости накопления продуктов реакции от времени, () - субстрат ^*23U, () - субстрат *23C.

Из рисунка видно, что со временем происходит накопление продукта расщепления ОДН-субстрата. Для каждой стадии развития были подобраны оптимальное время, за которое расщеплялось хорошо детектируемое количество субстрата и зависимость количества расщепленного продукта от времени была линейной. Если активность в экстракте была слишком высокой, его разводили в 5-10 раз добавлением буфера, использовавшегося для диализа. Типичная картина радиоавтографа представлена на рис. 7

Рис. 7. Радиоавтограф геля после электрофоретического разделения продуктов реакции расщепления ОДН ^*23U и контрольного ОДН *23C экстрактами эмбрионов S. intermedius. Дорожки: 1 - контроль подвижности - субстрат ^*23U после 5 мин. инкубации с АР-эндонуклеазой, (3 мкг) 2 - субстрат *23U после 5 минут инкубации без экстракта, 3 - субстрат *23C после 5 минут инкубации без экстракта 4,5 - субстраты *23U и *23C после 20 минут инкубации с экстрактом стадии 12, 6,7 - то же со ст.15, 8,9 - то же ст.18, 10,11 - то же ст 20, 12,14 - то же ст.24, 15,16 - то же ст. 25, 17,18 - то же ст. 26., S - субстрат, P - продукт реакции.

Скорость реакции определяли как количество расщепленного субстрата в минуту. Относительная скорость, нормированная на содержание общего белка в пробе, была взята в качестве показателя активности урацил-ДНК-гликозилазы. Полученные для трех серий экспериментов данные представлены на рис. 8. Видно что активность урацил-ДНК гликозилазы резко возрастает после вылупления бластулы и достигает максимума на стадии 52 часа развития. Такой же профиль активности наблюдался ранее для нуклеаз S. intermedius [35].

Рис. 8 Удельная активность урацил-ДНК-гликозилазы на разных стадиях эмбрионального развития S. intermedius. А - линейная шкала по оси ординат, Б - логарифмическая шкала по оси ординат (для сравнения активности на ранних стадиях развития).

3.4.2 Активность 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы

Вторая серия экспериментов была направлена на выявление активности оксогуанин-ДНК-гликозилазы. Так как этот фермент выщепляет модифицированные основания только из двуцепоченой ДНК, использовался 23-звенный двуцепочечный субстрат ^*23oG/23comp. На рис. 9 представлен типичный радиоавтограф геля для экстракта стадии 3 в присутствии 5 мМ ЭДТА.

Рис. 9. А. Радиоавтограф геля после электрофоретического разделения продуктов реакции расщепления ОДН ^*23oG/23comp и ^*23G/23comp экстрактом эмбрионов на стадии 3 S. intermedius в присутствии 5 мМ ЭДТА. Дорожки 1-4 - субстрат ^*23oG/23comp после 2, 5, 10, 20 мин. инкубации с экстрактом; дорожка 5 - субстрат ^*23oG/23comp после 5 мин. инкубации с белком Fpg (3мкг); дорожка 6 - субстрат ^*23oG/23comp после 5 мин. инкубации без экстракта; дорожки 7-8 - субстрат ^*23G/23comp после 2 и 20 мин. инкубации с экстрактом. S - субстрат, P - продукт.

Как видно из рис. 9, в присутствии 5 мМ ЭДТА активности 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы не наблюдалось. Такая же картина была и в случае экстрактов на всех имеющихся стадиях развития. Такой результат имеет два возможных объяснения. Во-первых, в эмбрионах морского ежа экспрессия гена данного фермента может находиться на очень низком уровне или отсутствовать вообще. Во-вторых, 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза обладает большим сродством к ДНК и после выщепления поврежденного основания очень медленно диссоциирует из комплекса с продуктом реакции, поэтому низкие концентрации фермента могут плохо выявляться при исследовании его активности. Показано, что активность 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы человека OGG1 стимулируется AP-эндонуклеазой - следующим участником пути ЭРО. В присутствии AP-эндонуклеазы скорость диссоциации OGG1 из комплекса с ДНК возрастает. Однако AP-эндонуклеза, как и другие нуклеазы, нуждается в ионах Mg²⁺, а ЭДТА в реакционной смеси хелатирует двухвалентные ионы металлов, ингибируя таким образом активность нуклеаз. Поэтому эксперимент повторяли без добавления ЭДТА, но в присутствии 1 мМ Mg²⁺. На рис. 10 представлен радиоавтограф такого геля:

Рис. 10 Радиоавтограф геля после электрофоретического разделения продуктов реакции расщепления ^*23oG/23comp и ^*23G/23comp экстрактом эмбриона S. Intermedius на стадии 3 в присутствии ионов магния. Дорожки 1,6 - субстрат ^*23oG/23comp после 5 мин. инкубации с белком Fpg (3мкг), 2-5 - субстрат ^*23oG/23comp после 2, 5, 10, 20 мин. инкубации с экстрактом; дорожка 7 - субстрат ^*23оG/23comp после 5 мин инкубации без экстракта; дорожка 8 - субстрат ^*23G/23comp после 5 мин. инкубации без экстракта. S - субстрат, P - продукт.

На начальной стадии реакции наблюдается быстрое накопление продукта, по подвижности соответствующего продукту расщепления поврежденного ОДН ферментом Fpg. То, что продукт инкубации с экстрактом обладает большей электрофоретической подвижностью, чем контроль с чистым ферментом, объясняется тем, что после выщепления остатка оксогуанина гликозилазой, ее продукт подвергается гидролизу АР-эндонуклеазой. Поэтому для построения графиков накопления продукта от времени был выбран временной промежуток от 2 до 20 минут. На рис.11 приведен пример графика, использовавшегося для вычисления скорости реакции, и график удельной активности 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы по стадиям развития.

Рис. 11 А. - График накопления продукта реакции от времени, стадия 3, () - субстрат ^*23oG/23comp, () - субстрат *23C/23comp. Б - удельная активность 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы на разных стадиях развития эмбрионов S. intermedius.

Из графика Б видно, что 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазная активность падает по мере развития эмбриона.

Помимо ферментативных активностей, выщепляющих из ДНК основания Ura и 8-oxoGua, была исследована способность экстрактов эмбрионов S. intermedius на разных стадиях развития удалять поврежденные основания дигидроурацила (из пар с Gua), 8-оксоаденина (из пар с Cyt), гипоксантина (из пар с Thy) и Ade (из пар с 8-oxoGua). Первый из этих субстратов специфичен для ДНК-гликозилаз NTHL1 и NEIL1, второй -- для OGG1 и NEIL1, третий -- для MPG, четвертый -- для MUTYH ($). Однако ни в одном из случаев расщепления на уровне выше неспецифического фонового обнаружено не было (данные не приведены), что говорит об отсутствии или низкой удельной активности соответствующих ферментов.

3.4.3Активность AP-эндонуклеазы

AP-эндонуклеаза расщепляет двуцепочечную ДНК с 5'-стороны от AP-сайта, оставляя ОН-группу на 3'-конце разрыва и dRP-остаток на 5'конце. Для измерения ее активности часто используют олигонуклеотиды, содержащие стабильный аналог AP-сайта - тетрагидрофуран, который не подвергается ?-элиминированию, как спонтанному, так и катализируемому AP-лиазами. Такой субстрат использовали для анализа активности AP-эндонуклеазы в экстрактах икры и сперматозоидов морского ежа. Так как продуктом действия AP-эндонуклеаз является ДНК с одноцепочечным разрывом, анализируемые образцы не требовалось инкубировать со щелочью перед электрофорезом. Как уже упоминалось, AP-эндонуклеаза является Mg²⁺-зависимой, поэтому реакция проводилась в отсутствие ЭДТА и в присутствии ионов Mg²⁺ в концентрации 1 мМ. Для учета неспецифической деградации субстрата экстракт инкубировали с контрольным дуплексом ^*23G/23comp, последовательность которого была такой же, за исключением поврежденного звена.

Рис. 12. Радиоавтограф геля после электрофоретического разделения продуктов реакции расщепления ОДН-субстратов ^*23THF/23comp и ^*23G/23comp экстрактами эмбрионов S. intermedius. Дорожки 1, 2 - субстрат ^*23THF/23comp и ^*23G/23comp соответственно после 20 мин инкубации с экстрактом стадии 5. Дорожки 3, 4 -- то же для стадии 7. Дорожки 5, 6 -- то же для стадии 10. Дорожки 7, 8 - то же для стадии 11. Дорожка 9 -- субстрат ^*23THF/23comp после 5 мин инкубации с AP-эндонуклеазой APEX1 человека (3 мкг). Дорожка 10 -- субстрат ^*23THF/23comp после 5 мин инкубации без экстракта. Дорожка 11 -- субстрат ^*23G/23comp после 5 мин. инкубации без экстракта. Дорожки 12, 13 - субстрат ^*23THF/23comp и ^*23G/23comp соответственно после 20 мин инкубации с экстрактом стадии 12. Дорожки 14, 15 -- то же для стадии 15. Дорожки 16, 17 -- то же для стадии 18. Дорожки 18, 19 -- то же для стадии 20. Дорожки 20, 21 -- то же для стадии 24. S - субстрат, P - продукт расщепления ОДН по остатку THF.

Как видно из рис. 12, за 20 минут инкубации происходило накопление продукта, по подвижности соответствующего продукту AP-эндонуклеазы. Для расчета удельной активности, скорость в молях расщепленного субстрата в минуту нормировалась на концентрацию белка в экстракте. Полученные данные для трех серий экспериментов приведены на рис. 13

Из рис. 13 видно, что активность AP-эндонуклеазы постепенно возрастает с развитием. Это характерно также для общей нуклеазной активности экстаракта - на поздних стадиях она значительно выше, чем на ранних.

Рис. 13 Удельная активность АР-эндонуклеазы на разных стадиях развития эмбрионов S. intermedius.

3.4.4 Активность ДНК-полимераз

На третьем этапе ЭРО происходит заполнение однонуклеотидной бреши, образовавшейся в результате действия ДНК-гликозилаз и AP-эндонуклеаз. С 3'-ОН концом разрыва связывается репаративная полимераза (ДНК-полимераза ? в случае высших эукариот) и включает один дезоксинуклеотид, а далее происходит либо лигирование ДНК, либо переключение на длиннозаплаточный путь ЭРО со сменой ДНК-полимераз. Для исследования ДНК-полимеразной активности экстрактов был сконструирован субстрат, содержащий 23-звенную матрицу, основной праймер (длиной в 10 нуклеотидов) и запирающий праймер (12 нуклеотидов), между которыми находилась однонуклеотидная брешь (*Primer1*Primer2/Template). Подобные структуры свляются оптимальными субстратами для реакции, катализируемой ДНК-полимеразой ?. В реакционную смесь добавляли dATP в концентрации, насыщающей ДНК-полимеразу, который использовался полимеразой для встройки в брешь напротив основания Thy в матрице. Пробы анализировали электрофорезом в денатурирующих условиях, что позволило отделить удлиненный основной праймер от исходного. На рис. 14 представлен типичный радиоавтограф такого геля.

Рис. 14 Радиоавтограф геля после электрофоретического разделения продуктов реакции встраивания dAMP в субстрат ^*Primer1*Primer2/Template экстрактами эмбрионов S. intermedius. Дорожки 1-8 -- субстрат после 5 мин инкубации с экстрактами стадий 3, 5, 7, 10, 11, 12, 15 и 18 соответственно. Дорожка 9 -- субстрат после 5 мин инкубации без экстракта. Дорожка 10 -- субстрат после 2 мин инкубации с 500 нМ ДНК-полимеразой ? человека. S -- субстрат, P1 -- продукт включения dAMP, Р2, Р3, Р4 -- продукты неспецифической деградации нуклеазами.

Из рис. 14 видно, что на ранних стадиях развития полимеразная активность значительно выше, чем на поздних. Однако на стадии 12, соответствующей вылуплению бластулы, наблюдается всплеск активности, после чего она снова падает. Тем не менее, даже на этих стадиях нельзя однозначно говорить об отсутствии ДНК-полимеразной активности, так как в реакционном буфере содержался 10 мМ МgCl₂, который используют в качестве кофактора нуклеазы, и наблюдается частичная деградация субстрата. Поэтому эксперимент отражает сочетание полимеразной и нуклеазной активностей экстрактов. Данные по удельной активности полимеразы на всех стадиях развития представлены на рис. 15

Рис. 15 Удельная полимеразная активность на разных стадиях развития эмбрионов S. Intermedius

Таким образом, в работе показано изменение активности ключевых ферментов эксцизионной репарации оснований в эмбриональном развитии морского ежа. S. intermedius. Согласно полученным данным, активность урацил-ДНК-гликозилазы резко возрастает после стадии вылупления бластулы. Это может быть связано с тем, после вылупления из оболочки оплодотворения эмбрион находится в непосредственном контакте с окружающей средой, содержащей множество агентов, способных повредить ДНК. Однако активность 8-оксогуанин-ДНК гликозилазы напротив, убывает с развитием, что говорит о сниженной способности клеток репарировать окислительные повреждения ДНК на поздних стадиях эмбрионального развития.

Активность AP-эндонуклеазы, следующего участника пути ЭРО, находится на относительно высоком уровне в течение всего эмбриогенеза. Это показывает важность репарации апурин-апиримидиновых сайтов, которые являются серьезным нарушением структуры ДНК и приводят к остановке репликативной вилки, что очень существенно для активно делящихся клеток эмбриона. AP-эндонуклеаза расщепляет как спонтанно возникающие AP-сайты, так и AP-сайты, появляющиеся в результате действия ДНК-гликозилаз. На фоне возрастающей активности урацил-ДНК-гликозилазы последняя функция AP-эндонуклеаз может играть существенную роль, хотя статистически достоверной корреляции между этими двумя активностями не наблюдается (r = 0,132, p > 0,05).

Полимеразная активность экстрактов характеризуется нестандартным профилем - высокая активность на ранних стадиях развития, которая затем падает, но на стадии вылупления бластулы происходит значительный всплеск. Возможно, падение обусловлено тем, что в первые часы развития активная репликация ДНК в эмбрионе происходит за счет фонда ДНК-полимераз, запасенного в яйцеклетке. Постепенно этот фонд расходуется, что приводит к падению удельной активности. На стадии же вылупления бластулы всплеск может быть обусловлен началом экспрессии собственных генов полимераз эмбриона. Дальнейшее определение полимеразной активности затруднено ввиду возрастания общей нуклеазной активности в экстрактах.

ВЫВОДЫ

1. Показано наличие активности урацил-ДНК-гликозилазы в экстрактах эмбрионов Strongylocentrotus intermedius на ранних стадиях развития. Показано, что удельная активность этого фермента резко возрастает после стадии вылупления бластулы и достигает максимума к стадии формирования личинки (плутеуса).

2. Показано наличие активности 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы на ранних стадиях развития эмбрионов S. intermedius. Измерена удельная активность этого фермента, показано ее существенное снижение с развитием эмбриона.

3. Показано наличие активности апурин-апиримидиновой эндонуклеазы экстрактах эмбрионов S. intermedius на разных стадиях развития. Показано, что удельная активность этого фермента в целом возрастает с развитием, однако на поздних стадиях становится трудно детектируемой за счет возрастания общей нуклеазной активности.

4. Измерена общая активность ДНК-полимераз в клеточных экстрактах эмбрионов S. intermedius на разных стадиях развития. Показано, что удельная ДНК-полимеразная активность максимальна в первые три часа развития, после чего происходит существенный спад, однако на стадии вылупления бластулы имеет место заметный всплеск активности.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. von Sonntag C. Free-Radical-Induced DNA Damage and Its Repair: A Chemical Perspective. - Berlin-Heidelberg: Springer, 2006. - 523 pp.

2. Nathan C., Shiloh M. U. Reactive oxygen and nitrogen intermediates in the relationship between mammalian hosts and microbial pathogens. // Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. - 2000. - Vol. 97. - № 16. - p. 8841-8848.

3. Schrader C. E., Linehan E. K., Mochegova S. N., Woodland R. T., Stavnezer J. Inducible DNA breaks in Ig S regions are dependent on AID and UNG. // J. Exp. Med. - 2005. - Vol. 202. - № 4. - p. 561-568.

4. Cadet J., Douki T., Gasparutto D., Ravanat J.-L. Oxidative damage to DNA: Formation, measurement and biochemical features. // Mutat. Res. - 2003. - Vol. 531. - № 1-2. - p. 5-23.

5. Zharkov D. O. Base excision DNA repair. // Cell. Mol. Life Sci. - 2008. - Vol. 65. - № 10. - p. 1544-1565.

6. Wood M. L., Dizdaroglu M., Gajewski E., Essigmann J. M. Mechanistic studies of ionizing radiation and oxidative mutagenesis: Genetic effects of a single 8-hydroxyguanine (7-hydro-8-oxoguanine) residue inserted at a unique site in a viral genome. // Biochemistry. - 1990. - Vol. 29. - № 30. - p. 7024-7032.

7. Turk P. W., Laayoun A., Smith S. S., Weitzman S. A. DNA adduct 8-hydroxyl-2'-deoxyguanosine (8-hydroxyguanine) affects function of human DNA methyltransferase. // Carcinogenesis. - 1995. - Vol. 16. - № 5. - p. 1253-1255.

8. Shapiro R., Klein R. S. The deamination of cytidine and cytosine by acidic buffer solutions. Mutagenic implications. // Biochemistry. - 1966. - Vol. 5. - № 7. - p. 2358-2362.

9. Hill-Perkins M., Jones M. D., Karran P. Site-specific mutagenesis in vivo by single methylated or deaminated purine bases. // Mutat. Res. - 1986. - Vol. 162. - № 2. - p. 153-163.

10. Wuenschell G. E., O'Connor T. R., Termini J. Stability, miscoding potential, and repair of 2'-deoxyxanthosine in DNA: Implications for nitric oxide-induced mutagenesis. // Biochemistry. - 2003. - Vol. 42. - № 12. - p. 3608-3616.

11. Greer S., Zamenhof S. Studies on depurination of DNA by heat. // J. Mol. Biol. - 1962. - Vol. 4. - - p. 123-141.

12. Lindahl T., Nyberg B. Rate of depurination of native deoxyribonucleic acid. // Biochemistry. - 1972. - Vol. 11. - № 19. - p. 3610-3618.

13. Chen Y.-H., Bogenhagen D. F. Effects of DNA lesions on transcription elongation by T7 RNA polymerase. // J. Biol. Chem. - 1993. - Vol. 268. - № 8. - p. 5849-5855.

14. Sun B., Latham K. A., Dodson M. L., Lloyd R. S. Studies of the catalytic mechanism of five DNA glycosylases: Probing for enzyme-DNA imino intermediates. // J. Biol. Chem. - 1995. - Vol. 270. - № 33. - p. 19501-19508.

15. Fortini P., Dogliotti E. Base damage and single-strand break repair: Mechanisms and functional significance of short- and long-patch repair subpathways. // DNA Repair. - 2007. - Vol. 6. - № 4. - p. 398-409.

16. Lee H.-M., Hu Z., Ma H., Greeley G. H., Jr, Wang C., Englander E. W. Developmental changes in expression and subcellular localization of the DNA repair glycosylase, MYH, in the rat brain. // J. Neurochem. - 2004. - Vol. 88. - № 2. - p. 394-400.

17. Dengg M., Garcia-Muse T., Gill S. G. Abrogation of the CLK-2 checkpoint leads to tolerance to base-excision repair intermediates. // EMBO J. - 2006. - Vol. 10. - - p. 1046-51.

18. Hildrestrand G. A., Diep D. B., Kunke D., Bolstad N., Bjшrеs M., Krauss S., Luna L. The capacity to remove 8-oxoG is enhanced in newborn neural stem/progenitor cells and decreases in juvenile mice and upon cell differentiation. // DNA Repair. - 2007. - Vol. 6. - № 6. - p. 723-732.

19. Kim N. K., Lee S. H., Sohn T. J., Roy R., Mitra S., Chung H. M., Ko J. J., Cha K. Y. Spatial expression of a DNA repair gene, N-methylpurine-DNA glycosylase (MPG) during development in mice. // Anticancer Res. - 2000. - Vol. 20. - № 5A. - p. 3037-43.

20. Shi L., Kent R., Bence N., Britt A. B. Developmental expression of a DNA repair gene in Arabidopsis. // Mutat. Res. - 1997. - Vol. 384. - № 3. - p. 145-156.

21. Meyer-Siegler K., Rahman-Mansur N., Wurzer J. C., Sirover M. A. Proliferative dependent regulation of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase/uracil DNA glycosylase gene in human cells. // Carcinogenesis. - 1992. - Vol. 13. - № 11. - p. 2127-32.

22. Choi Y., Gehring M., Johnson L., Hannon M., Harada J. J., Goldber R. B., Jacobsen S. E., Fischer R. L. DEMETER, a DNA glycosylase domain protein, is required for endosperm gene imprinting and seed viability in Arabidopsis. // Cell. - 2002 -Vol. 110. - № 1. - p. 33-42.

23. Rai K., Huggins I. J., James S. R., Karpf A. R., Jones D. A., Cairns B. R. DNA demethylation in zebrafish involves the coupling of a deaminase, a glycosylase, and Gadd45. // Cell. - 2008. - Vol. 135. - № 7. - p. 1201-1212.

24. Zhu B., Zheng Y., Angliker H., Schwarz S., Thiry S., Siegmann M., Jost J.-P. 5-Methylcytosine DNA glycosylase activity is also present in the human MBD4 (G/T mismatch glycosylase) and in a related avian sequence. // Nucleic Acids Res. - 2000. - Vol. 28. - № 21. - p. 4157-4165.

25. Zhu B., Zheng Y., Hess D., Angliker H., Schwarz S., Siegmann M., Thiry S., Jost J. P. 5-methylcytosine-DNA glycosylase activity is present in a cloned G/T mismatch DNA glycosylase associated with the chicken embryo DNA demethylation complex. // Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. - 2000. - Vol. 97. - № 10. - p. 5135-9.

26. Jost J. P., Fremont M., Siegmann M., Hofsteenge J. The RNA moiety of chick embryo 5-methylcytosine- DNA glycosylase targets DNA demethylation. // Nucleic Acids Res. - 1997. - Vol. 25. - № 22. - p. 4545-4550.

27. Jost J. P., Schwarz S., Hess D., Angliker H., Fuller-Pace F. V., Stahl H., Thiry S., Siegmann M. A chicken embryo protein related to the mammalian DEAD box protein p68 is tightly associated with the highly purified protein-RNA complex of 5-MeC-DNA glycosylase. // Nucleic Acids Res. - 1999. - Vol. 27. - № 16. - p. 3245-52.

28. Gilbert S.F. Developmental Biology. - Sunderland: Sinauer Associates, 2010. - 711 pp.

29. Masuda M., Sato H. Asynchronization of cell divisions is concurrently related with ciliogenesis in sea urchin blastulae. // Dev. Growth. Diff. - 1984. - Vol. 26. - № 3. - p. 281-294.

30. Lepage T., Sardet C., Gache C. Spatial expression of the hatching enzyme gene in the sea urchin embryo. // Dev. Biol. - 1992. - Vol. 150. - № 1. - p. 23-32.

31. Brooks J. M., Wessel G. M. The major yolk protein in sea urchins is a transferrin-like, iron binding protein. // Dev. Biol. - 2002. - Vol. 245. - № 1. - p. 1-12.

32. Yokota Y., Unuma T., Moriyama A., Yamano K. Cleavage site of a major yolk protein (MYP) determined by cDNA isolation and amino acid sequencing in sea urchin, Hemicentrotus pulcherrimus. // Comp. Biochem. Physiol. - 2003. - Vol. 135. - № 1. - p. 71-81.

33. Астауров Б.Л. Объекты биологии развития. - М.: Наука, 1975. - 216 pp.

34. Shastina V.V., Menzorova N.I., Sibirtsev Y.T., Rasskazov V.A. Purification and characteristics of Ca²⁺,Mg²⁺- and Ca²⁺,Mn²⁺-dependent and acid DNases from spermatozoa of the sea urchin Strongylocentrotus intermedius. // Biochemistry (Mosc.). - 2003. - Vol. 68. - № 5. - p. 582-592.

35. Сибирцев Ю.Т., Мензорова Н.И., Шастина В.В., Рассказов В.А. Множественность ДНКаз в спермиях морского ежа Strongylocentrotus intefmedius. // Докл. РАН. - 2001. - Vol. 367. - № 1. - p. 117-119.