Холера
Работа из раздела: «
Медицина»
Владивостокский Государственный Медицинский Университет
Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии
Р е ф е р а т
Холера
Выполнил: Новак А.Л.
301 гр. л/ф
Владивосток, 1998.
Этиология
Возбудитель холеры относится к роду Vibrio. Это изогнутая,
грамотрицательная, не образующая споры палочка, имеющая один полярно
расположенный жгутик. По чувствительности к специфическому фагу (IV тип по
Мукерджи) различают два биотипа холерного вибриона — классический
(возбудитель азиатской холеры) и Эль-Тор. Каждый из них по 0-антигену
подразделяется на 3 серологических типа: Огава (АВ), Инаба (АС) и редко
встречающийся Гикошима (АВС), который некоторые авторы рассматривают как
вариант серотипа Огава. Н-антиген холерных вибрионов — общий для всех
серотипов.
Холерные вибрионы образуют термолабильный экзотоксин — холероген
(относительная молекулярная масса — 82—84 кд). Он состоит из комплекса
тяжелой субъединицы А, активирующей аденилатциклазу, и субъединицы В,
представленной 4—6 легкими цепями и обеспечивающей связывание холеро-гена с
рецепторами эпителиальных клеток тонкой кишки.
Биолого-патогенетические свойства возбудителя
Миновав желудочный барьер, вибрионы попадают в тонкую кишку с
благоприятной для них средой и заселяют (колонизируют) поверхность
кишечного эпителия. Процесс колонизации включает в себя хемотаксис
вибрионов к слою слизи, покрывающему верхушки ворсинок тонкой кишки,
проникновение через эту слизь, адгезию к рецепторам на исчерченной каемке
кишечных эпителиоцитов и размножение на поверхности эпителия ворсинок и
крипт. У больных холерой возбудитель может быть обнаружен на всем
протяжении желудочно-кишечного тракта. В желудке при рН не менее 5,5
вибрионы не обнаруживаются, в стуле их концентрация достигает 106—107
(иногда ^—Ю9).
Размножившись до определенной концентрации, возбудитель вызывает
заболевание посредством вырабатываемого им холерогена. Основную роль в
развитии болезни играют вибрионы, которые находятся в тесной связи со
слизистой оболочкой тонкой кишки, так как они выделяют холероген в
непосредственной близости от его рецепторов на эпителиальных клетках — ган-
глиозида GM1. После прикрепления холерного токсина к ганглиозиду
субъединица А проходит через мембраны внутрь эпителиальной клетки, где
происходит высвобождение фрагмента А1. Последний энзиматически расщепляет
НАД и передает его АДФ-рибозную половину на регуляторный протеин
аденилатциклазного комплекса, находящегося на внутренней стороне мембраны
эпителиоцита. В результате происходит активация аденилатциклазы, приводящая
к повышению содержания цАМФ — одного из внутриклеточных стимуляторов
кишечной секреции. Связывание холерного токсина с рецепторами на
эпителиальных клетках происходит чрезвычайно быстро (через 1—3 мин);
биохимические нзменения в клетке являются необратимыми.
Возникающее заболевание сопровождается потерей огромных количеств
жидкости с низким содержанием белка и высокой концентрацией ионов натрия,
калия, хлоридов, гидрокарбонатов. Эта жидкость по составу отличается как от
экссудата, так и от транссудата и ближе к составу кишечного секрета.
Восприимчивость
К холерному вибриону восприимчивы люди всех возрастов. Чаще и тяжелее
болеют холерой лица, злоупотребляющие алкоголем или перенесшие резекцию
желудка. Кислотность желудочного сока играет важную роль в определении
минимальной инфицирующей дозы — в опытах на добровольцах при нейтрализации
желудочного сока гидрокарбонатом натрия количество вибрионов, необходимых
для воспроизведения специфического процесса у человека, уменьшается с 10'
до 104—10Ь микробных клеток.
Клинические особенности
Инкубационный период при холере длится от 1 до 5 дней. Клинические
проявления холеры весьма варьируют, и тяжесть клинического течения
определяется степенью обезвоживания. Заболевание начинается обычно
внезапно. Первым клинически выраженным признаком холеры является понос.
Типичные холерные испражнения представляют собой водянистую, мутновато-
беловатую жидкость с плавающими хлопьями, напоминают по внешнему виду
рисовый отвар и не имеют запаха. Мышечная слабость и судороги в икроножных
мышцах — ранние симптомы холеры. Вслед за жидким стулом появляется обильная
повторная рвота, быстро приводящая к декомпенсированному эксикозу. Кожные
покровы становятся цианотичными, холодными на ощупь, черты лица
заостряются, глаза и щеки западают. Кожа кистей рук морщинистая («руки
прачки»), голос сиплый, вплоть до афонии. У больных с тяжелой формой холеры
отмечается гипо-термия. Из-за ее постоянства терминальная форма холеры (IV
степень дегидратации) получила название «алгидная». Алгид
(декомпенсированное обезвоживание) сопровождается нарушением деятельности
основных систем организма — сердечно-сосудистой, дыхательной,
мочевыделительной.
Иммунологическая диагностика
Обнаружение антигена. Возбудитель холеры и его специфические антигены
(корпускулярный, растворимый, холероген) выявляют в фекалиях, рвотных
массах, крови, дуоденальном и кишечном содержимом, желчном пузыре, в
объектах окружающей среды (смывы с различных предметов), в воде открытых
водоемов, сточных водах, гидробионтах и др.
Из современных методов индикации антигенов холерного вибриона наибольшее
распространение получила РНГА, чувствительность которой с антительными
эритроцитарными диагностикумами составляет 105—101' бактерий в 1 мл или
0,04 мкг/мл 0-антигена. При клинически выраженных формах холеры, когда в
испражнениях больных содержится огромное количество вибрионов (10'—109 в 1
мл), прямое исследование фильтратов прогретых на водяной бане испражнений в
РНГА с антительным диагностикумом позволяет дать ответ о наличии
специфического антигена уже через 2-—3 ч. Рвотные массы больных,
испражнения вибриононосителей и контактных лиц, содержащие меньшее
количество вибрионов, целесообразно исследовать после предварительного 6-
часового подращивания на 1% пептонной воде. При исследовании испражнений и
рвотных масс оказалось, что лишь в 52% случаев диагноз холеры был
подтвержден бактериологически у больных, в анамнезе значительной части
которых имелось указание на употребление антибиотиков при появлении первых
признаков заболевания. С помощью РНГА заболевания холерой удалось
дополнительно установить еще у 21 % больных [Поляков И. И. и др., 1973].
При исследовании испражнений, содержимого кишечника и желчного пузыря
умерших от острых кишечных заболеваний, испражнений здоровых лиц и проб
воды обычно в практических условиях наблюдали полное совпадение результатов
серологического и бактериологического методов исследования, что позволяет
считать РНГА с антительным эритроцитарным диагностикумом достаточно
надежным экспресс-методом при массовом обследовании на холеру.
Некоторыми авторами при индикации специфических антигенов холерного
вибриона отдается предпочтение РТНГА. Холерные диагностикумы для этой
реакции готовят из бараньих или человеческих О (I) группы эритроцитов,
сенсибилизированных холерными 0-антигенами. Чувствительность метода —
104—106 бактерий в 1 мл при исследовании нативных испражнений и 10'—105 —
после предварительного подращивания. Минимальное количество 0-антигена,
выявляемого с помощью РТНГА, равно 0,04—0,16мкг/мл. РТНГА дает
положительные результаты у 91% больных холерой, у 40% ре-конвалесцентов и
12% контактировавших с больными, 0-антиген холерного вибриона может быть
определен через 1 мес от начала заболевания в фекалиях у всех переболевших
людей, а спустя 5—6 мес — у половины обследованных, что, по-видимому,
свидетельствует о более длительной экскреции специфического антигена в
нежизнеспособной форме. Совпадение результатов бактериологического метода и
РТНГА, по различным данным, наблюдается в 63—100% случаев. Имеющиеся
материалы дают основание считать целесообразным широкое испытание РТНГА.
Положительную оценку при диагностике холеры получил МФА, позволяющий
выявлять холерные вибрионы при содержании их не менее 10° в 1 мл.
Использовать МФА целесообразно при исследовании нативного материала от
больных и трупов. У больных холерой положительные результаты с помощью МФА
были получены в течение 2 ч в 70—90% наблюдений при полном совпадении с
результатами бактериологического анализа. Применение МФА при исследовании
воды и смывов возможно лишь после предварительного подращивания или
концентрирования материала. Представляется перспективным использование
иммунотушевой окраски холерных вибрионов.
Для выявления антигенов холерного вибриона применяют агрегат гемаг-
глютинационную пробу (АГГ). В основе её лежит использование для агрегации и
фиксирования белков иммунной сыворотки на эритроцитах химического вещества
из группы диазосоединений в виде препарата диазоль черного С. Эритроциты,
сенсибилизированные агрегированными белками холерной 0-сыворотки, обладают
высокой специфичностью и чувствительностью. С их помощью удается определить
0,01—0,005 мкг/мл «цельного» растворенного антигена, приготовленного по
методу Буавена, и 4000—480 000 клеток холерного вибриона в микробных
взвесях. Это позволяет считать АГГ одним из наиболее чувствительных
иммунологических методов, который оправдал себя при обследовании людей. С
помощью АГГ 0-антиген холерного вибриона обнаружен в 88,2% больных холерой
и 78,3% вибриононосителей, причем в титрах 1 : 40 и выше 0-антиген
определен у 76,1% больных и у 57,1% вибриононосителей. Серологически
активный компонент эндотоксина обнаруживают в высоких титрах, чаще у
тяжелых больных и в первые 3—5 дней болезни. В период реконвалесценции
количество антигена в сыворотке крови снижается, но у 33% больных он
сохраняется до 20—25 дней [Покровский В. И., Малеев В. В., 1978]. Для
определения холерогена, помимо биопроб, используют и иммунологические
методы — РНГА и АГГ. В опытах с бесклеточными супернатантами культур
холерных вибрионов порог чувствительности обоих методов составлял
0,01—0,005 мкг/мл.
Антительный ответ. Инфицирование человека холерным вибрионом ведет к
местному и системному ответу. Клинически выраженное заболевание холерой
сопровождается ростом уровня сывороточных антимикробных (агглютинирующих и
вибриоцидных) и токсиннейтрализующих антител, как правило, уже к концу 1-й
недели после появления симптомов болезни. Агглютинины к холерному вибриону
к 4-му дню заболевания выявляют у 35,7% больных, на 8-й день — практически
у всех (98,6%). Уровень агглютининов достигает максимума на 2-й неделе
заболевания (на 11—15-й день титры, равные 320 и выше, регистрируют у 71%
больных), а затем резко падает. Титры вибриоцидных антител также
увеличиваются к 8—10-му дню заболевания и после 3 нед (иногда несколько
раньше) начинают снижаться, достигая первоначального уровня через 2—7 мес.
У детей до 4 лет падение титра вибриоцидных антител происходит быстрее, чем
в старшей возрастной группе (5—14 лет), достигая исходного уровня уже через
3 мес. Динамика титров токсиннейтрализующих антител имеет сходный характер
— появляясь в конце 1-й недели, они достигают максимума между 2-й и 3-й
неделями, а с 21-го дня снижаются.
Содержание сывороточных IgM и I gG на протяжении болезни сопоставимо с
аналогичными показателями в контрольной группе, хотя есть данные об
увеличении уровня IgM в острой стадии и снижении его в период
реконвалесценции. Некоторые исследователи не установили разницы в
содержании IgA при поступлении больных в стационар и в стадии
реконвалесценции; другие отмечают повышение его уровня у переболевших
[Покровский В. И., Малеев В. В., 1978; Адамов А. К., 1981]. Сказанное не
дает достаточных оснований утверждать, что изменение уровня сывороточных
иммуно-глобулинов при холере носит специфический характер.
Специфическая активность иммуноглобулинов различных классов зависит от
формы и длительности инфекционного процесса при холере. Антитела в
сыворотке крови переболевших относятся, преимущественно к IgM. У
вибриононосителей продуцируются, наоборот, высокоактивные IgG-антитела.
Активность IgA-антител в сыворотке крови вибриононосителей незначительно
выше по сравнению с больными. Чем тяжелее протекает заболевание, тем выше
активность продуцируемых антител, относящихся к иммуноглобули-нам класса М,
и ниже активность IgG-антител.
Самым простым и легко воспроизводимым методом определения антимикробных
антител является РА с живыми культурами холерного вибриона, но
чувствительность этой реакции ограничена. Диагностические титры (1 :
: 40 и выше) появляются, как правило, к концу 1-й недели заболевания, но
лишь у 19,7% больных холерой. Исследование парных сывороток, полученных с
интервалом 7—10 дней при наличии 4-кратного и более нарастания титров
антител увеличивает частоту положительных результатов до 89,6%
Гораздо большее значение придается в настоящее время выявлению виб-
риоцидных антител. Вибриоцидный тест (ВТ) является более чувствительным в
сравнении с РА, давая высокие титры, особенно у реконвалесцентов холеры (до
1 : 100 000). Нужно, однако, иметь в виду, что вибриоцидные антитела (титры
до 1 : 1000) могут обнаруживаться и в сыворотках невакцинированных здоровых
людей, никогда не болевших холерой, и у лиц, инфицированных бруцеллами,
Yersinia enterocolitica 09, цитробактером. Агглютинины относительно меньше
чувствительны к такой неспецифической стимуляции. Как и РА, ВТ позволяет
регистрировать подъем специфических антител (4-кратный и более) у 90—95%
больных с бактериологически подтвержденным диагнозом холеры [Watanabe Y.,
1974].
В качестве антигена в РА и ВТ используют холерные вибрионы обоих
серотипов. При необходимости пользоваться одним предпочтение отдают
серотипу Огава, который чаще, чем Инаба, вступает в перекрестные реакции с
гетерологичным серотипом холерного вибриона и реже дает неспецифические
реакции с микробами других семейств.
Хотя эти серологические реакции являются наиболее чувствительными,
необходимость применения в них живых вибрионов создает определенные
трудности при массовых обследованиях. Поэтому наибольшего внимания
заслуживают антигенные эритроцитарные диагностикумы, которые позволили
внедрить в практику РНГА и РТНГА. Эти реакции обладают достаточной
чувствительностью и специфичностью, позволяя обнаруживать антитела у
больных и переболевших холерой в титрах 1 : 640—1 : 1280. Наблюдаемые
различия в титрах при параллельном использовании РНГА и ВТ обусловлены
главным образом различиями в физико-химической природе выявляемых антител:
IgG-антитела более эффективно обнаруживают бактерицидным методом (ВТ), IgM-
антитела — в РНГА.
Для выявления антитоксинов в сыворотках применяют РН, результаты которой
учитывают по отсутствию холерогенного эффекта в перевязанной петле тонкой
кишки взрослых кроликов, в кишечнике крольчат-сосунков, на коже морских
свинок (кроликов) в опытах in vivo и по отсутствию цитото-нического
действия в культуре клеток СНО и Y-1 — в опытах in vitro. Наиболее
стандартизованы кожная проба и модель перевязанной кишечной петли. У 73%
больных в эндемичном по холере районе с помощью кожной пробы выявлено
диагностически значимое 9-кратное и большее увеличение титров
токсиннейтрализующих антител. Частота сероконверсии вибриоцидных антител и
агглютининов в этой же группе больных была выше и составила 98 и 88%
соответственно [Watanabe Y., 1974].
Анализ титров антитоксических антител при диареях нехолерной этиологии
показал, что в пробах сывороток, взятых в острой стадии болезни, они
колебались от << 10 до 270, но значимое нарастание титров в период рекон-
валесценции было отмечено лишь у 2,5% больных. Обладая высокой
специфичностью, метод определения токсиннейтрализующих антител несколько
уступает по чувствительности методам определения вибриоцидных и
агглютинирующих антител. Высокой разрешающей способностью обладают ИФМ и
РИМ, использующие меченный энзимом или радиоактивным веществом антиген и
позволяющие определять связывание 0,001—1 нг иммунного белка исследуемой
сыворотки.
Титры антитоксических антител, регистрируемые ИФМ, выше титров, которые
определяются с помощью внутрикожного теста, что обусловлено различиями в
выявляемых классах иммуноглобулинов: кожный тест документирует
нейтрализующую активность только IgG-антител, вероятно, в силу их большей
авидности, в то время как ИФМ регистрирует и уровень IgM-антител.
Таким образом, изучение титров и динамики нарастания циркулирующих
антител в сыворотках крови больных при холере расширяет возможности ее
лабораторной диагностики. Ретроспективный диагноз холеры с большей степенью
вероятности может быть установлен в РА и ВТ, но лишь на основании изучения
парных сывороток больных. Определение уровня антитоксина полезно в тех
случаях, когда необходимо исключить предшествующую специфическую
вакцинацию, так как антитела этого типа не индуцируются существующими
холерными вакцинами и очень редко встречаются у здоровых людей. Однако
подъем антитоксических титров у больных на фоне диагностически значимой
сероконверсии вибриоцидных и агглютинирующих антител повышает достоверность
серологической диагностики холеры.
Возникновение патологического процесса, вызванного холерными вибрионами,
ведет к появлению антител к этим микроорганизмам и во внешних секретах
пищеварительного тракта — интестинальной жидкости (ко-проантитела) и слюне.
Отличительной чертой динамики копроантител является их раннее появление (у
72% — на 2—3-й день болезни, у 100% — на 4-й день) и быстрое исчезновение
из кишечного содержимого. В интестинальной жидкости выздоравливающих от
холеры людей антитела против вибрионов относятся к иммуноглобулинам A, G и
М, но преобладающими являются SIgA-антитела, количество которых у больных
холерой возрастает примерно в 30 раз, но составляет около '/4 того, что
наблюдается у больных диарейными заболеваниями нехолерной этиологии.
Последнее связано с адсорбцией SIgA на холерных вибрионах, что приводит к
стойкому снижению количества вибрионов в стуле больных и сокращает
продолжительность их выделения из кишечника. Концентрация этого
иммуноглобулина и время его появления в кишечном содержимом не связаны с
сывороточным IgA. Количество IgG- и IgM-антител в кишечном содержимом
реконвалесцентов холеры также увеличивается (в 5—7 раз), но в фекалиях
антитела класса IgM не обнаруживают.
Для обнаружения антител в интестинальной жидкости и фекалиях больных
могут быть использованы ВТ, РИМ с холерными антигенами, меченными
радиоактивным йодом, непрямой флюоресцентно-серологический метод.
Нарастание специфических антител указывает на наличие заболевания холерой.
Однако кишечно-копрологическая диагностика холеры еще недостаточно
разработана.
В слюне больных и вибриононосителей повышен уровень IgA и IgG.
Одновременно появляются и специфические антитела (агглютинины), содержание
которых у больных холерой выше, чем у виброноносителей (30 АЕ и 14 АЕ
соответственно). Диагностический титр специфических агглютининов слюны
может оказаться значительно ниже сывороточного.
Определению состояния повышенной чувствительности при холере в реакции
ГЗТ посвящены единичные работы. Описаны положительные аллергические реакции
у 89% переболевших холерой и вибриононосителей (при отсутствии их в
контрольной группе) в ответ на внутрикожное введение аллергена из убитых
холерных вибрионов. Однако имеющихся данных недостаточно, чтобы высказать
суждение об аллергической перестройке организма при холере или о
диагностической значимости применяемых тестов.
Иммунитет
После болезни у человека вырабатывается выраженный иммунитет, который
сохраняется длительное время, поэтому случаи повторных
заболеваний холерой крайне редки. Опыты на добровольцах показали, что в
течение 3 лет (срок наблюдения) люди, переболевшие холерой в результате
экспериментального заражения, оставались устойчивыми к повторному заражению
холерными вибрионами [Levine M. et al., 1981].
Основная роль в иммунитете к холере принадлежит антителам, продуцируемым
местно (в кишке), хотя определенный вклад в защиту вносят циркулирующие
антитела при высоких их концентрациях, когда они проникают в просвет кишки
из крови, что подтверждено экспериментами на животных. Более высокий
уровень защиты наблюдается при синергическом действии антибактериальных и
антитоксических антител в кишке. Основная роль антибактериальных SIgA
состоит в том, чтобы препятствовать хемотаксису вибрионов к эпителию и
прилипанию их к поверхности слизистой оболочки кишечника в результате
блокирующего действия на структуры для прилипания (лиганды) на поверхности
бактериальных клеток. Снижение колонизации и адгезии холерных вибрионов
способствует более быстрому их выведению из кишечника при перистальтике и
тем самым уменьшает возможность приживления возбудителя в кишечном тракте.
Действие кишечных IgA-антител против холерогена обусловлено главным
образом блокадой его В-субъединицы, что препятствует связыванию токсина с
ганглиозидом GM1 на поверхности эпителиоцитов. Антитела, блокирующие
токсический сайт на А-субъединице холерогена, оказывают меньшее защитное
действие.
Список использованной литературы
1. Л.Б. Хазенсон, Н.А. Чайка: Иммунологические основы диагностики и
эпидемологического анализа кишечных инфекций. «Медицина»,1987.
2. В.Д. Тимаков, В.С. Левашев, Л.Б.Борисов: Микробиология. «Медицина»,
1983.
3. Лекция по теме.
4. Методическая разработка кафедры.
